草酸铵结晶紫染液的配制

一、配制

溶液A：结晶紫 2克；95%酒精 20毫升

溶液B：草酸铵 0.8克；蒸馏水 80毫升

1.将A、B溶液混合，用滤纸过滤后即可使用。

2.结晶紫滴一滴即可，不需多用，以避免污染桌面及手指。

二、结晶紫染色法测定细胞数

1．在96孔细胞培养板各孔中加0.1ml含5×104～10×4 WEHI-164细胞的培养液（含10%小牛血清的RPMI-1640培养液），37℃ 5% CO2的二氧化碳培养箱中培养2～3小时，让细胞帖壁。

2．用RPMI-1640培养液10倍递次稀释TNF标准品，根据需要3～5倍递次稀释待检样品，每孔加0.1ml稀释的标准品或待检样品，每个稀释度3个重复孔。对照孔6个，3个阳性对照孔各加0.1ml含4μg TNF的RPMI-1640培养液，3个阴性对照孔各加100μl RPMI-1640培养液。继续培养18～24小时。

3．甩去培养液，用PBS小心洗涤一次，每孔加0.1ml 10%甲醇溶液固定细胞30秒钟。

4．吸去甲醇溶液，每孔加0.1ml结晶紫染液，室温中放置20分钟。

5．轻轻甩去染色液，用蒸馏水洗涤各孔，将培养板倒置于吸水纸上吸干水分。自然干燥或37℃烘干。此板可以在室温中长期保存。

6．测定前，每孔加0.1ml 33%醋酸脱色，充分振荡后在570nm处测定光吸收度。用光吸收度（OD）值对样品稀释度作图，比较标准品曲线和待检样品曲线即可得到待测样品中的细胞因子活性