维生素B2 (核黄素) 荧光测定法实验

实验方法原理 核黄素能形成一种具有黄绿色荧光的黄色溶液。它在稀溶液中，440～500 nm波长下测定的荧光强度与核黄素的浓度成正比。根据其在还原后的荧光差数，可测定核黄素的含量。 实验材料 核黄素 试剂、试剂盒 高锰-酸钾溶液 荧光红钠 硫代硫酸钠 冰醋-酸 仪器、耗材 荧光分光光度计 玻璃器 溶液配制： 1. 3 %高锰-酸钾溶液：将高锰-酸钾3 g溶于水，稀释至100 ml，每星期配制一次。 2. 核黄素标准溶液（0.5 μg/ml）：取储备液（25 μg/ml）1 ml，稀释至50 ml，临用前配制。 3. 荧光红钠储备溶液（50 μg /ml）：50 mg荧光红钠溶于1000 ml水中。 4. 荧光红钠应用液（0.05 μg/ml）储备液稀释至1000 ml。 操作步骤： 1. 样品提取 （1）称取含有核黄素5～10 μg的均匀样品于125 ml锥形瓶中，加入50 ml 0.1 mol/L盐酸，置于高压下蒸煮30 min。 （2）将样品冷却，用氢氧-化钠调至pH 6.0（因核黄素在碱性溶液中不稳定，滴加碱液时边加边摇，避免局部碱性过强），再迅速用1 mol/L盐酸调至pH 4.5，使杂质沉淀。 （3）用水稀释至100 ml，过滤。如样品量过大，可过滤后稀释，样品稀释度由所用标准液浓度来定。 2. 滤液酸化 （1）取两个试管（A），分别加入10 ml滤液和1 ml水。 （2）另取两个试管（B），分别加入10 ml滤液和1 ml核黄素标准液（0.5 μg/ml）。 （3）以上四个管各加1 ml冰醋-酸。 3. 纯化 （1）每个试管各加入0.5 ml 3%高锰-酸钾，混匀后放置2 min以充分氧-化样品内的杂质。 （2）另取两个试管（C），分别加入10 ml滤液和1 ml水及1 ml冰醋-酸，然后向两支试管中各加入20 mg硫代硫酸钠，使样品中的杂质与核黄素都还原成无荧光物质，再摇动，使核黄素与空气接触而被氧-化，测其荧光。 （3）在A、B管内各加0.5 ml 3%双氧-水（其不宜过量，以免产生气泡，影响荧光读数），混匀，10 s内褪去颜色。 4. 荧光测定 （1）用荧光红钠溶液调整指针，使之每次都在一定的读数上（如50～80）。 （2）滤液加水的荧光读数为A。 （3）滤液加标准液的荧光读数为B。 （4）滤液内加硫代硫酸钠的荧光读数为C。