一文教你如何准确评估分离的核酸样品的质量？

测序作为一种重要的实验技术，在生物学研究中有着广泛的应用。随着科学的发展，传统的 Sanger 测序已经不能完全满足研究的需要，对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序，都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，而高通量测序技术（High-throughput sequencing）的产生则是对传统测序一次革命性的改变。 二代、三代测序（NGS）的文库制备，对测序结果的影响很关键，而文库质量的好坏除建库方法和过程细节外，最重要的就是初始样本的质量。如何准确评估分离的核酸样品是否具有足够高的质量？ 我们将通过以下案例为大家详述。 核酸质量评分：DNA 通过计算基因组质量评分（DQN），可以高效地评估gDNA的质量。由 Qsep 开发用于片段分析仪，数据分析软件评估每个样品与用户定义的特定应用阈值用于「高质量的 DNA」，并指定 0 到 10 之间的 DQN 值。数值反映高于定义的阈值的 DNA 的百分比。 不同 DQN 评分的基因组样本 核酸质量评分：RNA 有两个指标可用于评估 RNA 的质量。 软件计算RNA质量数（RQN），相当于RNA完整性数（RIN），RIN是广泛接受的总 RNA 完整性和质量指标。与RIN值类似，RQN 值范围为 1 到 10， 是基于专有的计算算法，考虑 RNA 电泳图谱的整个分布。 图 2 不同 RQN 评分的 RNA 样品 尽管 RIN / RQN 值是从新鲜组织分离的RNA的质量的可靠评价标准，但它们并不是降解福尔马林固定的石蜡包埋（FFPE）样品的RNA质量的十分有效的评价标准。 为了解决这个问题，Illumina 的科学家开发了 DV200 这个检测标准，它可以计算 RNA 片段大于 200nt 大小的百分比。 考虑到 DV200 值和二代文库产量之间的更强的相关性，与 RQN 值相比，DV200 的评价对于评估 FFPE RNA 质量是更为理想的。 不同 DV200 评分的 FFPE RNA 样品 基因组 DNA 和 FFPE DNA 使用 DNA 卡夹检测所测样品后，Qsep 软件可以自动准确地测定 gDNA 样本的大小和 DQN。 DNA 在福尔马林固定过程中经历了大量的化学修饰，包括与蛋白质交联和降解成较小的片段。 从 FFPE 样品中分离出的 DNA 质量因固定方法和标本组织年龄的不同而有很大差异。使软件中 Smear 功能可以对降解的 FFPE DNA 进行质量评估（如下图，以 1k 为阈值）。 它们提供 DQN 值进行简化的质量评估，用于指导以下内容： 1. 第一次扩增中使用的 PCR 循环次数 2. 打断所用的条件 3. 文库构建的质量 FFPE样本检测DQN情况对比 其后对这四个样品进行分批次建库，多批次结果均一致，对文库用 Qsep 进行片段检测，结果如下图。 对应样本的文库质控结果 如图所示，质量评分最低的最后一个样本，所构建文库大小显著偏小，引物二聚体残留较多，此外文库浓度也是4个文库中最低，且多批次一致。因此文库质量的好坏除建库方法和过程细节外，最重要的还是初始的样本质量。文库质量的高低也影响了后续测序的结果以及数据的结果，因此做好提取样品的质控是第一步，也是最关键的一步。 建库前样品 在文库构建前对样品进行片段打断时可以对打断的样品进行一次质控，用于检测打断的条带是否满足预期需求，以确定是否需要改变打断的条件。 打断样品的检测图 可通过软件 Smear 功能来确定片段的主要分布区间，以期得到最佳打断打断效果。 肿瘤液态活检中游离核酸提取质量的质控也是目前相对比较热门的方向，不少用户使用 Qsep 系列来检测 cfDNA 样品，Qsep 系列可以达到 pg 级的检测灵敏度，对于 cfDNA 样品的检测相对轻松，可以准确测定样品的目的区域和大片段核酸的分布比例 cfDNA 样品的检测图 单细胞测序中 RNA 反转录后的产物 cDNA 样品的检测，通过检测 cDNA 的片段分布来定是否能进行文库构建。 cDNA 样品的检测图 文库 不同的二代测序文库根据测序仪的读长需求会有不同的大小分布，软件可以根据调点的分布准确的测定条带的分布区间，使用 Smear 分布功能，可以准确计算文库的平均片段以及主要片段集中区域。 文库的片段分布检测图 以上案例结果均来自 Qsep 系列全自动毛细管电泳评估分离的核酸样品的质量， Qsep 系列全自动毛细管电泳仪 Qsep 系列全自动毛细管电泳仪可在高通量测序中进行全程的样品质控，为稳定高质量的数据产出提供保证，让文库的构建的每一步都可以清晰的进行回溯。 不同通量的 Qsep 系列全自动毛细管电泳仪 采用可抛弃式的预制胶卡夹，即插即用，全自动进样，无须人工制胶、灌胶、上样，免去了手工制胶的繁琐，能让一般用户在短时间内学会操作系统，并自动分析样品得出结果。可用于 DNA、RNA 和蛋白检测 ，通量灵活，可处理 1-100 个任意个数样本。且具有单通道和四通道型号仪器，可满足不同用户需求，单次使用样本量极少，且最低检测限为 pg 级。