樊嘉团队首次全面深度剖析早期复发性肝癌的肿瘤免疫微环境

肝癌是全球癌症相关死亡率排名第四的癌种，而其中75%-85%为肝细胞肝癌（HCC）。目前HCC最有效的治疗手段是手术切除，但是其具有极高的复发率（术后5年复发率为50%-70%），其中术后2年内的早期复发更是占复发性HCC的70%，并且几乎让医生束手无策，生存率极低【1】。HCC的临床结果让人沮丧，而这背后的分子机制却一直不为人所知。

近年来，随着免疫检查点阻断（ICB）疗法在某些类型癌症的临床治疗中初见成效，人们期望以此改善HCC的治疗，却也是事与愿违，HCC对免疫治疗的反应并不令人满意。这其中一个很大的原因在于肿瘤复杂的生态系统，而全面细致地了解这个由多种异质性细胞（包括恶性细胞、免疫细胞和基质细胞）通过时空相互作用而形成的肿瘤生态系统，必将对肿瘤的发展、预后和治疗产生重大的影响。毫无疑问，肿瘤的免疫微环境对ICB治疗效率有着重要的影响【2】。复发性肿瘤常根据原发肿瘤的分子和病理特征进行治疗，但事实上它们是否具有相似的微环境特征尚未得到评价。因此，深入剖析HCC的肿瘤生态系统无疑将有助于了解HCC的免疫逃逸机制，并很可能为HCC尤其是复发患者提供更有效的免疫治疗策略。已有一些研究从单细胞层面描述了原位HCC的免疫细胞和肿瘤细胞异质性图谱【3,4】，但是在单细胞分辨率水平上对早期复发HCC的肿瘤生态系统和免疫表型的描述仍是空白。

2020年12月23日，来自复旦大学中山医院的樊嘉院士团队在Cell上在线发表题为“Single-cell landscape of the ecosystem in early-relapse hepatocellular carcinoma”的文章，对来自18个原发性或早期复发性HCC患者的16,498个细胞进行全长单细胞转录组测序，首次深度全面地剖析了早期复发性HCC的肿瘤免疫微环境。发现在早期复发性肿瘤中的恶性细胞具有更高的免疫逃逸特性，从而可能抑制树突细胞激活CD8+T细胞的能力。揭示了与HCC复发相关的免疫应答改变的独特方面，为HCC合理的免疫治疗提供了重要指导。

为了了解早期复发HCC的肿瘤生态系统，本文的研究人员收集了12例未经治疗的原发性HCC患者和6例早期复发性HCC患者的外科手术肿瘤样本和配对的癌旁组织，用细胞分选（FACS）分离CD45+和CD45-细胞，然后对通过质控的16,498个细胞进行单细胞测序（scRNA-seq），作为发现队列（discovery cohort）。此外，研究人员招募另外4名患者（包括配对的原发性样本PT和早期复发性样本RT）为验证队列1（validation cohort 1），同时来自另外的47名患者的配对的PT和早期RT样本用于免疫组化（IHC）和批量RNA测序验证，为验证队列2（图1）。

根据测序结果，研究人员鉴定并区分出24类细胞集群，并且发现RT和PT具有相同的主要免疫细胞亚型（包括骨髓源性细胞、T细胞、B细胞、浆细胞和自然杀伤细胞）和相似的淋巴源性和骨髓源性细胞比例。但是，进一步对骨髓源性细胞和T细胞/NK细胞进行无监督聚类分析发现，与原发性HCC肿瘤微环境相比，复发性HCC具有其独特的免疫生态系统，表现为树突细胞（DC）比例增加，Treg细胞减少，T细胞增殖减少，CD8+ T细胞丰度更高。这些发现也被验证队列1的scRNA-seq以及验证队列2的IHC结果所进一步证实了。

随后，研究人员利用Monocle（构建细胞的状态转换轨迹的软件）推断HCC浸润的CD8+ T细胞的动态免疫状态和细胞转换轨迹，而根据与转换状态相关的转录变化可以将CD8+ T细胞群分为4期。1期细胞的主要特点是CCR6、CCR7、NCR3和KLRB1的表达上调，而GZMA、GZMB和GZMH的表达降低，提示细胞毒性能力最低；2期细胞的JUN、FOS、NR4A1、NR4A3的表达水平最高，与肝驻留记忆细胞表型相匹配；3期的特征是典型的细胞毒性基因表达水平升高，T细胞衰竭标记物表达水平降低；4期的特征是与T细胞衰竭相关基因的水平升高。结果显示在PT和RT样本中CD8+ T细胞表现出相同的转换轨迹，但却表现出明显不同的免疫和转录状态。RT样本中的CD8+ T细胞主要表现为1期和2期特征，只有少数表现为耗尽的4期，表明存在一种常驻记忆表型；相反，PT中的CD8+ T细胞主要为3期和4期细胞特征，表明从细胞毒性向衰竭状态的过渡过程（图2）。由此提示治疗原发性和复发性HCC应考虑不同的免疫治疗策略。

对RT样本中CD8+ T细胞的独特转录状态进行进一步的分析发现，与PT样本中的衰竭状态截然不同，RT样本的CD8+ T细胞中KLRB1过表达，表现为先天性功能失调状态，并且细胞毒性和免疫抑制较低。同时值得注意的是，KLRB1高表达CD8 T细胞相关基因表达信号的富集与复发性和原发性HCC的预后和肿瘤进展密切相关。此外，研究人员还发现，RT样本中CD8+ T细胞几乎没有表现出克隆性扩增，而RT样本中CD8+ T细胞的非活化表型可能是由于在复发肿瘤细胞中丢失了匹配的新抗原。由此提示由于肿瘤的选择（部分原因）CD8+ T细胞克隆在RT中处于低增殖和无反应状态，这些细胞不能识别和消除带有亚克隆新抗原的复发肿瘤细胞。

那么PT和RT之间肿瘤生态系统的如此巨大的差异是由什么造成的呢？答案是两者恶性细胞之间的差异。研究人员发现RT中的恶性细胞表现出免疫逃逸能力的增强和细胞增殖能力的减少。复发的恶性细胞可以通过PD-L1-CD80和CTLA4-CD80轴破坏DC细胞的抗原呈递，并通过CCL20-CCR6轴招募先天性CD161+CD8+T细胞，从而在早期复发的HCC中形成功能失调的抗肿瘤免疫。

综述所述，本文提供了一个全面的单细胞转录组图谱来描述原发性和早期复发性HCC的肿瘤生态系统，揭示了早期复发性HCC的独特的免疫生态系统，其特征为典型免疫抑制细胞Treg的比例降低，DC和先天性CD161+CD8+T细胞的比例增加，具有功能失调的细胞毒性和低增殖能力（图3），为理解免疫环境如何影响肿瘤复发迈出了重要的一步。同时揭示了HCC复发恶性细胞与免疫细胞之间存在着积极的相互影响，从而促进了肿瘤细胞逃避抗肿瘤免疫。由此将有助于开发更有效的治疗靶点和HCC患者的免疫治疗的生物标志物。