金黄色葡萄球菌耐药性检测（一）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种人畜共患的致病菌，可引发人和动物的中毒和感染。近年来由金黄色葡萄球菌引发的食物中毒（S. aureus food poisoning，SFP）事件屡见不鲜，主要是人们食用了污染金黄色葡萄球菌肠毒素的食物。研究表明，肠毒素由一组热稳定性的蛋白质组成，在100 ℃煮沸30 min后仍然具有生物活性和免疫活性。

目前根据肠毒素的催吐性，将金黄色葡萄球菌肠毒素划分为肠毒素和类肠毒素。在肠毒素/类肠毒素中，葡萄球菌肠毒素A（staphylococcal enterotoxin A，SEA）被认为是SFP暴发的主要原因，其次是葡萄球菌肠毒素D（staphylococcal enterotoxin D，SED）、葡萄球菌肠毒素C（staphylococcal enterotoxin C，SEC）、葡萄球菌肠毒素B（staphylococcal enterotoxin B，SEB）和葡萄球菌肠毒素E（staphylococcal enterotoxin E，SEE）。

近年来，羊奶粉作为一种新兴的奶粉品种，规模在不断扩大。羊奶是乳制品中最接近母乳、营养成分最全、最易被人体吸收的奶品，常作为婴幼儿配方奶粉的原料。有研究报道，一些金黄色葡萄球菌存在于婴幼儿配方奶粉中。虽然羊奶粉在加工生产过程中，都会经过巴氏杀菌杀死金黄色葡萄球菌等有害微生物，金黄色葡萄球菌产生的肠毒素仍可以导致人类食源性疾病。目前，对金黄色葡萄球菌在羊乳到乳制品生产链上污染情况的研究还比较少。了解羊乳加工到成品这一生产环节中金黄色葡萄球菌的污染情况，可以有效阻止其对乳制品的污染。

为进一步探明羊奶厂加工过程中受金黄色葡萄球菌污染的关键环节，本研究于2016年再次对其中一家羊奶粉加工厂不同生产环节进行金黄色葡萄球菌污染调查，并对分离菌株进行毒素基因、耐药性及葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A，SPA）、多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）和脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophpresis，PFGE）分型检测。通过了解不同环节金黄色葡萄球菌的污染情况和菌株的耐药性及分子特征，旨在确定金黄色葡萄球菌污染的关键环节及菌株特征，从而为有效防治羊奶粉加工过程中金黄色葡萄球菌污染提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样本来源

为了解羊奶粉加工过程中金黄色葡萄球菌的污染情况，随机选取了一家羊奶粉加工厂进行样本的收集。其中，样本的收集包括5 部分，分别为罐奶、加工设备、落地粉、加工人员以及成品。此次共采集样本112 份，其中罐奶23 份，加工设备35 份，加工人员10 份，落地粉29 份和成品15 份。

1.1.2 试剂

胰蛋白胨大豆琼脂（tryptic soy agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth，TSB）、甘露醇氯化钠琼脂、Baird-Parker（BP）基础培养基、亚碲酸盐卵黄增菌液、缓冲蛋白胨水（buffered peptone water，BPW）、7.5%氯化钠肉汤、Mueller-Hinton琼脂（Mueller-Hinton agar，MHA） 北京陆桥技术股份有限责任公司；Taq酶、Buffer（Mg2+-）、dNTP、MgCl2 大连宝生物（TaKaRa）公司；药敏实验16 种待测抗生素 北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

移液枪、高速离心机 德国Eppendorf公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪、凝胶成像仪 美国伯乐公司；超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；恒温培养振荡摇床 上海智成分析仪器制造有限公司；超纯水机 四川优普超纯科技术有限公司；隔水式恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司；高压灭菌锅 上海申安高压仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的采集

1.3.1.1 粉状及液态样本的采集

参照GB 4789.10—2016《食品微生物检验 金黄色葡萄球菌检验》方法进行。将收集的样品置于无菌袋中并记录样品相关信息，低温运送到实验室，其间隔不超过4 h。

1.3.1.2 加工设备及加工人员样本的采集

涂抹样品的采集和处理参照王倩宁等[11]方法。用无菌棉签涂抹加工设备表面和加工人员手部或鞋子表面，将涂抹样置于装有30 mL新鲜BPW培养液的离心管中，并对涂抹区域进行消毒处理，防止微生物滋生。

1.3.2 菌株的分离与鉴定

参照Wang Xin等方法对样本中金黄色葡萄球菌进行分离鉴定。对于液态或固态样本，称取25 g液体或者粉末样本于225 mL无菌BPW培养液中；涂抹样本不做处理，然后将盛有样本的BPW培养液至于恒温培养振荡摇床37 ℃、150 r/min培养18～24 h。将富集后的过夜培养液按照1∶10接种到30 mL 7.5%氯化钠肉汤中，37 ℃、150 r/min培养24 h。接着将培养后的菌液用接种环三线划法接种到BP平板上，37 ℃培养24 h。挑取可疑菌落接种在甘露醇平板中，做进一步鉴定。最后挑取甘露醇变色平板单菌落纯化在TSA平板37 ℃培养18～24 h。对纯化后的菌落用煮沸法制得DNA模板，并用PCR扩增nuc基因进行最后一步验证，nuc阳性的菌株被确定为金黄色葡萄球菌。将nuc基因阳性的所有菌株用棉签涮于50%的TSB-甘油管中，于-80 ℃冰箱保存。

1.3.3 毒素基因检测

运用PCR技术对所有的菌株进行23 种毒素基因检测。其中肠毒素基因21 种，包括：5 种经典肠毒素基因（sea、seb、sec、sed和see）和16 种新型肠毒素基因（seg、seh、sei、sej、sek、sel、sem、sen、seo、sep、seq、ser、ses、set、seu和sev）；杀白细胞毒素基因（pvl）和中毒休克综合征毒素基因（tsst-1）。

1.3.4 耐药性检测

根据临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI）推荐的琼脂稀释法，对分离到的6 株菌进行16 种常用抗菌药物的耐药性测定，并在37 ℃培养18～24 h后评估结果。16 种常用抗生素及最低抑菌浓度为：青霉素（penicillin，PEN，0.25 µg/mL）、氨苄西林（ampicillin，AMP，0.5 µg/mL）、苯唑西林（oxacillin，OXA，4 µg/mL）、红霉素（erythromycin，ERY，8 µg/mL）、四环素（tetracyclines，TET，16 µg/mL）、头孢西丁（cefoxitin，FOX，8 µg/mL）、头孢哌酮（cefoperazone，FOP，64 µg/mL）、氯霉素（chloramphenicol，CHL，32 µg/mL）、庆大霉素（gentamicin，GEN，16 µg/mL）、环丙沙星（ciprofloxacin，CIP，4 µg/mL）、利福平（rifampin，RIF，4 µg/mL）、万古霉素（vancomycin，VAN，16 µg/mL）、阿米卡星（amikacin，AMK，64 µg/mL）、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑（trimethoprim/sulfamethoxazole，T/S，4/76 µg/mL）、阿莫西林/克拉维酸（amoxicillin/clavulanic acid，A/C，8/4 µg/mL）和利奈唑胺（linezolid，LZD，8 µg/mL）。

药敏实验质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC 29213和大肠杆菌ATCC 25922。此外，运用PCR技术扩增mecA基因判断菌株是否为“超级耐药细菌”——耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant S. aureus，MRSA）。

1.3.5 分子分型

1.3.5.1 SPA分型

运用PCR技术扩增spa基因，并将扩增产物送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序。然后将测序结果进行处理，在线提交至分析网站http://spaserver.ridom.de进行分析，以此确定SPA类型。

1.3.5.2 MLST分型

运用PCR技术扩增7 对管家基因，并进行测序，将测序结果提交至MLST数据分析网站进行分析，得到每个管家基因的等位基因谱，再递交至该网站，最终可获得每个菌株的ST型。

1.3.5.3 PFGE分型

参照王新等方法对分离株进行PFGE分型，分型中以Salmonella braenderup H9812为标准质控菌株，以SmaI和XbaI为内切酶分别对金黄色葡萄球菌和H9812进行酶切，采用BioMerics-3.00软件进行聚类分析。

1.4 数据统计及图表绘制

所有数据采用Excel 2016软件进行数据统计分析，并运用Word 2003绘制三线表。PFGE聚类图采用BioMerics-3.00软件进行聚类分析。

相关链接：金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，肠毒素，氯化钠，甘露醇，阿米卡星，青霉素，北纳生物

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