鼠李糖乳杆菌对动物体内黄曲霉毒素促排效果的研究（一）

黄曲霉毒素（aflatoxin，AFT）主要由黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）产生，是一类化学结构类似的二氢呋喃香豆素类衍生物。AFT共有20多种结构，最主要的4 种类型为AFB1、AFB2、AFG1和AFG，其中AFB1的致畸、致癌、致突变性及降低机体免疫功能的毒性最强，是诱发肝癌的主要原因之一，其致癌作用是由肝脏细胞色素P450酶系经过代谢产生AFB1-8,9-环氧化物导致，对人体肝脏、肾脏等器官具有极强的损害作用。AFB1广泛存在于玉米、花生和大豆等农作物中，因此人体在日常饮食中与AFT的接触很难避免，且长期低剂量摄入会对人体产生不良的影响。当人体长期摄入低剂量AFB1时，AFB1会强烈抑制人体的免疫功能从而降低人体免疫力。

目前对AFB1能起到有效控制的方法主要有物理法、化学法和生物降解法。物理法（如加热、辐射和等离子降解）虽方便高效，但成本较高;化学法（如臭氧、过氧化氢和酸处理）虽成本低，却容易造成二次污染;生物降解法虽稳定性差，却几乎无任何副作用，因此近年来研究的重点转移到微生物降解AFB1方面。鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosu）是革兰氏阳性菌，也是目前研究最深入的益生菌之一，市场上已经有许多与鼠李糖乳杆菌相关的成型产品，具有调节肠道微生态、抑制癌症和降低胆固醇等功效。

目前，一些体内实验结果表明，鼠李糖乳杆菌可吸附动物体内的AFB1，结合后一起排出体外。但目前，体内实验大多采用先通过灌胃高剂量AFB1对动物造成急性肝损伤或免疫缺陷，再给予鼠李糖乳杆菌对已患病动物进行治疗，但这种模型建立的方式与日常人体AFB1暴露的方式不同。因此，本实验为达到模拟鼠李糖乳杆菌吸附人体内AFB1的目的，采用对大鼠连续给予低剂量AFB1，并每日补充不同处理方式、不同菌体浓度的鼠李糖乳杆菌菌液的方法，通过测定大鼠血清生化及免疫等指标，确定鼠李糖乳杆菌降低动物体内AFB1的作用程度及效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

4 周龄SPF级雄性SD大鼠（体质量90～110 g，生产许可证号：SCXK（京）2016-0006） 北京维通利华实验动物技术有限公司。

AFB1 北京华安麦科生物技术有限公司;鼠李糖乳杆菌由东北农业大学乳品科学教育部重点实验室提供;二甲基亚砜 美国Sigma公司;磷酸盐缓冲液美国HyClone公司;免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）（IgA、IgG、IgM）质量浓度检测试剂盒 南京建成生物工程研究所有限公司;白细胞介素（interleukin，IL）-2、IL-4、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附测定试剂盒 上海江莱生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

ACS30型电子秤 浙江风华科技有限公司;HH-4数显恒温水浴锅 常州丹瑞实验仪器设备有限公司;DHP-9162电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司;MHBS-1096A酶标仪 南京德铁实验设备有限公司;3K15高速冷冻离心机 德国Sigma公司;755B紫外-可见分光光度计 上海精密仪器公司;DSX-280B高压灭菌锅 上海申安公司;Cobas-c501自动生化分析仪瑞士罗氏公司。

1.3 方法

1.3.1 鼠李糖乳杆菌培养

将鼠李糖乳杆菌接种到MRS液体培养基中，于37 ℃培养18 h并连续活化3 次后，3 000 r/min离心10 min，收集上清液及菌体，所得上清液即为鼠李糖乳杆菌发酵液。将菌体中加入生理盐水洗涤3 次后，用生理盐水重悬并按实验设计方法调整菌体浓度，即为鼠李糖乳杆菌活菌液。取鼠李糖乳杆菌活菌液用高压灭菌锅于121 ℃灭菌15 min，再用生理盐水重悬并调整菌体浓度，即为热灭活鼠李糖乳杆菌液。需确保实验中制得的灭活菌样品涂布于MRS固体培养基中于37 ℃培养48 h后无菌落产生。

1.3.2 实验动物饲养管理及分组

将大鼠饲养在明暗交替、温度（23±2）℃、相对湿度（32±2）%的标准环境中，自由获取食物和水。所有动物实验均符合东北农业大学实验动物中心的标准及规定。

灭活鼠李糖乳杆菌高、中、低剂量组每日分别灌胃0.5 mL菌体浓度为1010、109、108 CFU/mL的灭活鼠李糖乳杆菌悬液。鼠李糖乳杆菌发酵液高、低剂量组每日分别灌胃0.5 mL菌体浓度为109、108 CFU/mL的鼠李糖乳杆菌发酵上清液。连续灌胃4 周，每次取样实验前1 d对大鼠禁食，分别于饲喂第0、7、14、28天记录大鼠体质量，并在每个重复中随机取4～5 个发育正常的大鼠个体，麻醉后心脏取血，记录肝、肾等内脏质量。

1.3.3 血清肝功能生化指标的测定

于饲喂第0、7、14、28天每次随机取4～5 只大鼠空腹称体质量，经乙醚麻醉后心脏取血3 mL，放入4 ℃冰箱中静置12 h，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，收集血清。将制备好的血清用Cobas-c501自动生化分析仪检测血清天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）活力。

1.3.4 大鼠血清免疫因子质量浓度的测定

按1.3.3节方法制备血清，将血清于-20 ℃冰箱保存。取保存的血清，解冻后按照试剂盒说明书测定大鼠细胞因子IL-2、IL-4、TNF-α、IgA、IgG、IgM质量浓度。

1.4 数据处理与分析

实验数据均使用Statistix 8软件进行统计分析;组间显著性差异分析采用单因素方差分析，P＜0.05认为差异有统计学意义;用Origin 8.5软件作图;结果以平均值±标准差表示。

相关链接：鼠李糖乳杆菌，黄曲霉毒素b1，香豆素，血清，白细胞介素，发酵液，北纳生物

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