水果酵素自然发酵过程中优势菌群与有机酸变化规律分析(一)

随着人们生活水平的提高，对功能性食品的需求与日俱增。酵素以其丰富的营养成分、活性物质和健康益处，在亚洲国家深受青睐。水果酵素是以水果为原料，经过有益微生物群发酵得到的发酵产品。在发酵过程中通过微生物对水果自身营养及外加碳源的代谢，使得酵素体系中含有丰富的有机酸、酶、小分子氨基酸等代谢产物，具有多种有益功能活性，受到消费者及学术界的广泛关注。

酵素的发酵方式分为接菌发酵和自然发酵，接菌发酵是利用一种或者多种微生物作为起始发酵剂进行发酵。 自然发酵主要是依赖于水果和自然环境中的优势菌群进行发酵，具有更丰富的微生物组成和代谢过程，其品质和风味也优于接菌发酵。然而在自然发酵过程中，酵素体系中的微生物群落构成不断变化，生成不同的代谢物，且又受到代谢产物的影响，使其发酵规律难以掌控。目前关于酵素的研究主要是微生物群落或产物因子的单一研究，高庆超等通过高通量测序对黑果枸杞酵素在0～60 d中的微生物群落结构变化进行了研究，杜丽平等通过聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCRDGGE）研究了木瓜自然发酵酵素在0～42 d中的微生物多样性变化，杨小幸等对自然发酵苹果酵素的物质代谢变化和抗氧化性进行研究。在实际生产中，发酵过程中不同时间的微生物群落结构与代谢物的变化规律与酵素的品质、功能和安全性密切相关，发酵时间选择和过程调控需要结合微生物的群落结构变化以及产物实际情况进行综合考虑。其中有机酸既被微生物用作碳源和电子供体，又是微生物的发酵产物，有机酸积累所导致的酸性环境还对某些微生物有抑制作用。因此，亟待进行水果酵素发酵过程中的微生物群落与有机酸产物的动态变化综合分析与评价，这有助于阐明水果酵素的发酵过程，控制酵素产品品质，同时对酵素工业化生产具有重要意义。

本实验以3 种物料与糖典型比例的水果酵素为研究对象，研究其在发酵周期0～150 d不同发酵时期的微生物动态变化以及7 种主要有机酸变化过程，运用冗余分析（redundancy analysis，RDA）对微生物群落组成与有机酸变化联合分析，以期揭示水果酵素在自然发酵过程中的微生物共性演变规律及在演替过程中有机酸的环境推动力，为指导自然发酵水果酵素实际生产、实现水果酵素工业生产工艺改进和产品品质稳定提升提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果、香蕉、梨、山楂、火龙果、香橙、柠檬、柚子、葡萄、猕猴桃、红糖（一级品）、白砂糖（一级品）。

有机酸标准品 上海源叶生物科技有限公司；十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS） 北京索莱宝生物科技有限公司；β-巯基乙醇、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、去离子甲酰胺 美国Sigma公司；RNase、6×loading bufferv北京康为世纪 公司；PCR引物 深圳华大基因科技服务有限公司；其他均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

K5600型超微量分光光度计 北京凯奥科技发展有限公司；Multiskan FC酶标仪 美国Thermo公司；TGL 16M高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂；1260高效液相色谱仪 安捷伦科技有限公司；S1000TM PCR仪、PowerPac电泳仪 美国Bio-Rad公司；Tanon 4600SF全自动数码凝胶/化学发光图像分析系统 上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理
选取原料水果，等质量比混匀，无菌水清洁表面，均匀切块。结合预实验发酵情况与其他研究选择糖与物料的比例与发酵时间，将水果与红糖以质量比1∶1、2∶1、3∶1（水果酵素A、B、C）加入灭菌发酵罐中，封口，自然发酵，分别在发酵0、30、60、90、120 d取样，10 000 r/min离心10 min弃去沉淀，上清液即为水果酵素原液，-20 ℃条件下保存待测。

1.3.2 有机酸含量测定

待测样品用5%氨水调节pH 8.2，经SAX强阴离子柱纯化。甲醇活化小柱，纯净水平衡，取0.5 mL调节pH值后的样品过柱，控制流速1 mL/min，纯净水淋洗，6% HCl溶液洗脱，收集洗脱液，氮吹，纯净水定容。样品过0.45 μm微孔滤膜后用于高效液相色谱分析。

高效液相色谱条件：色谱柱为C18柱；流动相为0.02 mol/L KH2PO4溶液，pH 2.7（用磷酸调节）；等梯度洗脱20 min；流速0.6 mL/min；进样量10 μL；检测波长210 nm；检测温度30 ℃。

1.3.3 微生物多样性分析

1.3.3.1 样品总DNA扩增

根据CTAB法提取样品中DNA。样品细菌DNA经过2 轮扩增后进行DGGE分析。首先使用F27和R1541对DNA全长片段尝试第1轮扩增，然后使用带夹板的F338-GC和R518对细菌16S rDNA的V3区进行第2轮扩增，用于DGGE分析。实验所用的引物如表1所示。
                                                                             表1 引物序列

细菌PCR体系（50 μL）：25 μL Mix、20 μL ddH2O、2 μL F27（F338-GC）、2 μL R1541（R518）、1 μL模板。PCR扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30 个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃条件下保存。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。之后采用凝胶成像系统成像，-20 ℃保存备用。

1.3.3.2 DGGE与条带测序

对样品提取DNA的PCR产物进行DGGE检测。经过反复实验确定变性剂梯度范围25%～55%，Bisacrylamide为10%。两种不同变性浓度的溶液，分别加入13 μL四甲基乙二胺和65 μL 10%过硫酸铵溶液，迅速混匀，灌胶。待胶凝固后加入电泳装置，加入1×TAE缓冲液，缓冲液加热至60 ℃，在每个加样孔上样25 μL，200 V预电泳5 min，之后调整电压为120 V，电泳时间6 h。电泳结束后，取出胶板，去离子水清洗，加入固定液固定15 min，之后银染、显色、终止。使用凝胶成像仪观察凝胶，并拍照记录。采用Quantity One软件标记特异性条带，并回收条带，加入20 μL超纯水，在4 ℃过夜溶解凝胶块中的DNA。取5 μL凝胶浸出液进行PCR扩增，所用引物为不带夹板的F338和R518（表1）。电泳检测回收，由华大基因进行克隆测序，测序结果进行BLAST序列同源性比对。

1.4 数据分析

采用软件Quantity One读取DGGE图谱上条带的数目与光密度值，并进行UPMGA（非加权组平均算法）聚类分析，生成DGGE图谱相似性分析图，并根据DGGE数字化后的数据计算微生物多样性指数，包括微生物多样性指数、丰富度和均匀度指标，其按 式（1）、（2）计算：

式中：H为Shannon-Wiener指数；S为PCR-DGGE胶中条带数量（丰富度）；Pi为i条带所占百分比；EH为均匀度指数。

参考于松峰等的方法分别建立微生物丰度和有机酸的矩阵，微生物丰度数据使用百分比，利用Canoco for Windows 4.6 用于相关性分析。首先对物种数据进行去趋势对应分析（detrended correspondence analysis，DCA），根据每个排序轴的梯度长度对应选择单峰模型或线性模型，随后对其进行相应的模型排序分析，研究微生物群落组成与其代谢产物中多种有机酸的相关性。其他数据显著性分析使用SPSS 25.0。

2 结果与分析

2.1 有机酸的测定结果

图1 有机酸标准品（A）与样品A 0 d（B）高效液相色谱图

如图1所示，乳酸、柠檬酸、草酸和苹果酸是水果酵素中的主要有机酸，同时还含有少量的酒石酸、莽草酸和绿原酸，这与张思等关于市售酵素的研究结果相似，其发现在16 种市售酵素中含量较多的主要是乳酸和柠檬酸。

图2 水果酵素A、B、C在发酵过程中有机酸含量的变化

如图2所示，在发酵前后酵素中主要有机酸含量均发生变化。其中乳酸在有机酸中占比最高、变化最大，发酵0 d检测到样品A、B、C质量浓度为2.92～3.70 mg/mL， 在发酵过程中先增大后减小，在发酵120 d质量浓度为7.19～10.49 mg/mL。这可能由于乳酸菌发酵产生乳酸，导致发酵液pH值下降，而过低的pH值则会抑制乳酸菌的生长，此外，许多微生物可以在体内代谢将乳酸降解[19]。柠檬酸占比次之，发酵120 d质量浓度为5.79～7.93 mg/mL。乳酸菌可通过三羧酸循环产生柠檬酸，同时还可将柠檬酸分解产生乳酸。草酸、酒石酸、苹果酸含量在发酵过程中下降，可能是菌群的代谢作用导致；苹果酸含量在发酵90 d下降至0，是由于在发酵过程中乳酸菌可将苹果酸降解为乳酸，并释放CO₂。水果酵素中莽草酸在发酵过程中含量增加，在发酵0、30 d未检测到，但在发酵60、90、120 d检测到质量浓度在0.01～0.06 mg/mL范围内，这可能是微生物通过莽草酸途径产生莽草酸；绿原酸质量浓度约0.01 mg/mL，在检测范围内无明显变化规律。

相关链接：有机酸，十六烷基三甲基溴化铵，四甲基乙二胺,十二烷基硫酸钠，，丙烯酰胺，甲醇，硫酸铵，柠檬酸，酵素，北纳生物

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