反相高效液相色谱法测定消毒凝胶中的度米芬

度米芬为季铵盐类阳离子型表面活性消毒防腐剂，对革兰阳性、阴性细菌及真菌均有杀灭作用，以前常作为药物用于口腔、咽喉感染的辅助治疗，现广泛用于消毒杀菌产品中。2002版《消毒技术规范》没有规定其含量检测的方法。目前度米芬含量检测方法的研究主要集中在药物中度米芬的检测， 文献报道的方法有铬酸钾指示剂法、紫外分光光度法、薄层扫描法、离子对比色法等，这些方法在实际操作中干扰大、专属性不强，检测结果不理想；高效液相色谱法多参考 2015 版《中国药典》方法，该方法采用离子交换树脂色谱柱，实际操作中耐用性较差，且色谱峰飘移严重。因此建立一种操作简单，通用性强，可用于检测消毒产品中度米芬含量的方法具有重要意义。

笔者选用 C18 色谱柱，建立了反相高效液相色谱法测定消毒凝胶剂中度米芬的含量，并将该方法用于含度米芬的口腔抑菌喷液、妇炎净洗液、足廯净喷雾剂、宝宝肤康凝胶多种样品的测定，结果显示，该方法灵敏度高、重现性好，通用性强。

1　实验部分

1.1　主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：UltiMate3000 型；

电子天平：(1)XP56 型，感量为 0.001mg，(2)BSA224 型，感量为 0.0001g；

超纯水系统：Dura12 型；

度米芬对照品：纯度为 99.9%，批号为 100455–200401；

甲醇、乙腈：色谱纯；

十二烷基硫酸钠、磷酸二氢钠：分析纯；

磷酸、三乙胺：优级纯；

消毒凝胶及阴性制剂；

口腔抑菌喷液、妇炎净洗液、足廯净喷雾剂、宝宝肤康凝胶样品：委托检验样品；

实验用水为超纯水。

1.2　溶液配制

1.2.1　度米芬对照品溶液

用电子天平 (1) 精密称取度米芬对照品 10.855mg，置于 25 mL 容量瓶中，用流动相溶解并稀释至标线，摇匀，得 0.434 2 mg／mL 的度米芬对照品溶液，于 4℃冰箱中保存。

1.2.2　样品溶液

取样品约 5.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密吸取流动相 50 mL 对样品进行稀释，称量，超声 15 min 后，再称量，用流动相补足减失质量，过滤膜，即得样品溶液。

1.2.3　阴性空白溶液

取不含度米芬阴性消毒凝胶，按 1.2.2 样品溶液制备方法制备阴性空白溶液。

1.3　色谱条件

色谱柱：Shim-Pack VP–ODS C18 柱 (250 mm×4.6mm，5 μm) ；检测波长：269nm ；柱温：35℃；流动相：0.012 mol／L 十二烷基硫酸钠 ( 每 1 L 加 5 g 磷酸二氢钠及 4 mL 三乙胺，用磷酸调节pH值至3.0)–乙腈–甲醇(2∶6∶2)，流量为1.5mL／min ；进样体积：10 µL。

2　结果与讨论

2.1　样品溶媒的选择

分别选择水、甲醇、70% 乙醇和流动相［十二烷基硫酸钠–乙腈–甲醇 (2∶6∶2)］作为样品溶媒进行试验，结果发现，不同的溶媒对凝胶消毒剂中度米芬溶出结果影响不同，影响由大到小依次为流动相、甲醇、水、70%乙醇，这与基质溶解度及酸碱性有很大的关系，综合考虑选择以流动相作为样品溶液溶媒，这样既能使度米芬完全溶出又 能使基线平稳。

2.2　流动相的选择

度米芬为阳离子型药物，有文献报道采用 C18 色谱柱进行含量测定［12–13］，以0.012 mol／L 十二烷 基硫酸钠–乙腈(25∶75)为流动相，实际操作时发 现，度米芬色谱峰明显拖尾，故在该流动相体系中加 入三乙胺作为扫尾剂，当 1 L 水相中含 4 mL 三乙胺 时，度米芬的色谱峰无明显拖尾。参考中药化学成 分研究中的三元流动相系统 ，在原有的两元流 动相系统中引入甲醇，并调整比例对色谱峰进行优化，十二烷基硫酸钠、乙腈、甲醇的体积比为 2∶6∶2 时，色谱分离度佳且度米芬色谱峰对称性好。

2.3　色谱柱的选择

分别选择 5 种不同品牌、型号及柱长的 C18 色谱 柱：Inertsil ODS–3 柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，Phenomenex synergi polar 柱 (250 mm×4.6 mm，5μm)，Kromasil柱 (200 mm×4.6 mm，5 μm)，HypersilODS–2 柱 (250 L×4.6 mm，5 μm)，Shim-Pack VP–ODS 柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，在 1.3 色谱条件下进行比对试验，结果表明，在 5 种色谱柱中度米芬色谱峰保留时间均稳定，且无杂质干扰，该方法对色谱柱的选择性无特殊要求。由于 Shim-Pack VP–ODS柱相对其它两种色谱柱性能稳定，耐用、通用性强，故选择 Shim-Pack VP–ODS 柱。

2.4　系统适用性试验

分别精密吸取对照品溶液、样品溶液及阴性空白溶液 10 μL，依次注入液相色谱仪进行测定，色谱图如图 1 所示。

由图 1(a)可知，对照品溶液中度米芬色谱峰与其它杂峰完全分离（色谱峰理论塔板数 n=13 030）；样品溶液中度米芬色谱峰与其它杂峰完全分离，且峰形对称；阴性空白溶液中度米芬色谱峰峰形较好，无干扰峰。

2.5　线性关系与检出限

精密吸取度米芬对照品溶液 0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL，置于 10 mL 容量瓶中，用流动相稀释并定容至标线，摇匀，得质量浓度分别为 0，86.84，173.68，260.52，374.36，434.20 µg／mL 的系列标准工作溶液，在 1.3 色谱条件下分别进样测定。以度米芬的质量浓度 (X) 为横坐标，相应的色谱峰面积 (Y) 为纵坐标绘制标准工作曲线，得线性方程为Y=0.019 7X+0.000 4，线性范围为 0～434.20 µg／mL，相关系数 r=1。以信噪比 S／N ≥ 3 时对应的度米芬质量浓度确定检出限，得方法检出限为 0.13 µg／mL。

2.6　仪器精密度试验

精密吸取供试品溶液 10 μL，连续进样 6 次，记录色谱峰面积，结果见表 1。由表 1 可知，色谱峰面积测定结果的相对标准偏差为 1.17%，表明仪器的精密度良好。

2.7　稳定性试验

精密称取样品 5.0 g，按 1.2 方法制备供试品溶液，分别放置 0，2，4，6，8，10 h 后在 1.3 色谱条件下进样测定，测定结果见表2。

由表 2 可知，度米芬色谱峰面积测定结果的相对标准偏差为 1.08%，表明供试品溶液在 10 h 内稳定性良好。

2.8　方法精密度试验

精密称取样品 5.0 g，共 6 份，按 1.2 方法制备样品溶液，在 1.3 色谱条件下分别测定，测定结果见表3。由表 3 可知，度米芬峰测定结果的相对标准偏差为 1.13%，表明该方法的精密度良好。

2.9　加标回收试验

精密称取已知度米芬含量的样品 2.5 g，分别精密加入相当于含有 80%，100%，120% 度米芬的对照品溶液适量，按照 1.2 方法配制样品溶液，在 1.3 色谱条件下测定，结果见表 4。由表 4 可知，度米芬平均回收率为 97.80%，说明所建方法的准确度较高。

2.10　实际样品分析

按照 1.2 方法制备消毒凝胶剂（3 批）、口腔抑 菌喷液、妇炎净洗液、足廯净喷雾剂、宝宝肤康凝胶 产品的样品溶液，按实验方法进行测定，得度米芬含 量测定结果见表 5。由表 5 可知，消毒样品中度米 芬测定结果均在标示量范围内。

3　结语

通过不同供试品溶液溶媒、不同色谱柱的比较，系统适应性试验及高效液相色谱法方法学的验证，建立了反相高效液相色谱法测定消毒凝胶中度米芬含量的方法。该方法样品处理简单，灵敏度高，耐用性强，重复性好，通用性强，可广泛用于消毒杀菌产品中度米芬的含量测定。