离子色谱法同时测定蛋白胨中氯离子、 硫酸根离子、碘离子

摘要 建立离子色谱法测定蛋白胨中氯离子、硫酸根离子、碘离子 3 种阴离子的含量。采用氢氧化钾淋洗液发生器产生的 KOH 溶液为流动相，进行梯度淋洗，流量为 1.0 mL／min。氯离子、硫酸根离子的质量浓度分别在0.5～200 μg／mL 范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系，碘离子的质量浓度在 0.75～50 μg／mL 范围内与色谱峰面积呈良好的线性，线性相关系数均不小于 0.999，检出限分别为 0.003，0.01，0.22 μg／mL。样品加标回收率为92.94%～96.59%，测定结果的相对标准偏差为 2.42%~5.70%(n=9)。该方法灵敏、高效，可用于蛋白胨中氯离子、硫酸根离子、碘离子的快速准确测定。

在诸多食品安全风险中，微生物污染已成为全球公认的首要威胁，为了解决或降低微生物污染的危害，为大部分微生物提供适宜的生长繁殖或积累代谢产物的营养基质—培养基就变得尤为重要。

培养基的种类繁多，按组成物质的化学成分可分为天然培养基、合成培养基、半合成培养基。目前大多数实验室均选择天然培养基，利用动植物、微生物或其提取物制成的培养基，其优点是取材方便、营养丰富、种类多样、配制方便、价格低廉，缺点是成分不清楚且不稳定，在做精细科学实验时，会导致数据不稳定；合成培养基是一类用多种化学试剂配制成的、各成分的量均可确定的培养基，其优点是成分精确、重现性高，缺点是价格较贵、配制步骤较繁琐，一般用于营养、代谢、生理、生化等定量要求较高的研究工作中，目前我国这种培养基基本上是进口的。

在天然培养基和半合成培养基中，蛋白胨扮演着重要的角色，它是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成、外观呈淡黄色、具有肉香味的粉末，为微生物生长提供所需的主要营养氮源。

其在食品发酵工业及微生物检验等领域中的用量均很大。无机盐离子作为微生物生长过程中不可或缺的营养物质，是微生物细胞的组成成分，可以调节细胞的渗透压，还可以作为某些自养型微生物的能源，在其生长中起着重要作用。目前对于氯离子的测定，常用的方法有电位滴定法、硝酸银滴定法和硝酸汞滴定法；硫酸根离子的测定方法采用重量法 ( 氯化钡沉淀法 )、容量法 (EDTA 络合滴定 ) 和分光光度法；碘离子的测定一般采用氧化还原滴定法、分光光度法和气相色谱法。这些方法误差较大，检测速度较慢，操作较为繁琐，而且不能同时测定多种不同的离子。笔者采用离子色谱法同时对蛋白胨中的 3 种阴离子的含量进行了测定，方法准确，易于操作，为研制纯化学合成培养基以及提升我国培养基企业的质控技术水平提供基础数据。

1　实验部分

1.1　主要仪器与试剂

离子色谱仪：ICS5000+ 型，配有 EGC–500 淋洗液自动发生器、电导检测器、AERS–500 抑制器和Chromeleon 7.2.2 色谱工作站，美国赛默飞世尔科技公司；

超纯水系统：Milli-Q 型，默克密理博实验室设备 ( 上海 ) 有限公司；

电子天平：ME 204E 型，精度为 0.0001 g，瑞士梅特勒 – 托利多仪器有限公司；

超声波清洗机：FB15065 型，美国赛默飞世尔科技公司；

离心机：5430R 型，德国艾本德生命科学公司；

RP 柱：ICC 50／pKg，天津博纳艾杰尔科技有限公司；

Na 柱：ICC 50／pKg，天津博纳艾杰尔科技有限公司；

甲醇：色谱纯，美国赛默飞世尔科技公司；

乙酸：纯度 99.5%，国药集团化学试剂有限公司；

氯离子标准溶液：1 000 mg／L，编号为 GBW(E)082683，北京坛墨质检 – 标准物质中心；

硫酸根离子标准溶液：（1 000±4） mg／L，编号为 101723218，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；

碘化钾：纯度 99.0%，天津风船化学试剂科技有限公司；

实验用水为去离子水。

1.2　仪器工作条件

色谱柱：阴离子分离柱 AS11–HC(4.0 mm×250 mm，美国赛默飞世尔科技公司 ) ；阴离子保护柱 AG11 柱 (4.0 mm×50 mm，美国赛默飞世尔科技公司 ) ；淋洗液：EGC–500 淋洗液自动发生器产生不同浓度的氢氧化钾溶液 ( 浓度见表 1)，梯度洗脱，淋洗液流量为 1.0 mL／min，淋洗液氮气加压 40 kPa ；柱温箱温度：30℃；电导池温度：30℃；抑制器抑制电流：174 mA ；进样体积：100 L。

1.3　标准溶液配制

碘离子标准储备溶液：精密称取碘化钾 0.132 0 g 于 100 mL 容量瓶中，加去离子水溶解并稀释至标线，摇匀，配制成质量浓度为 1 000 μg／mL 的碘离子标准溶液，置于 4℃冰箱中冷藏保存。

碘离子标准工作溶液：分别准确移取碘离子标准储备溶液75，125，200，500，1 000，1 500，2 000，2 500，3 000，3 500，4 000，4 500，5 000μL于 100mL容量瓶中，用去离子水定容至标线，得到质量浓度分别 为 0.75，1.25，2，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50μg／mL 的碘离子系列标准工作溶液。

氯离子和硫酸根离子标准工作溶液：分别精密吸取氯离子和硫酸根离子标准溶液 5，50，100，200，500，800，1 000，2 000 μL 于 10 mL 容量瓶中，用去离子水定容至标线，得到质量浓度均分别为 0.5，5，10，20，50，80，100，200 μg／mL 的氯离子和硫酸根离子系列标准工作溶液。

1.4　样品前处理

精密称取 1.000 g 样品于 50 mL 容量瓶中，加入 40 mL 去离子水，超声提取 30 min，每隔 5 min 振摇一次，室温下放置，加入 3% 乙酸溶液 2 mL，并用去离子水定容至 50 mL，然后将溶液置入 50 mL 离心管中，于 4℃下放置 20 min，在离心机中以 5 000r／mim 离心 5 mim，取上清液备用。

RP 柱用 10 mL 甲醇和 15 mL 水依次通过，活化 0.5 h ；Na 柱用 10 mL 水活化 0.5 h。将样品上清液依次通过 RP 柱和 Na 柱净化，弃去前 3 mL 初滤液，收集滤液，定量稀释后，过 0.22 μm 微孔滤膜，待测。

2　结果与讨论

2.1　色谱条件优化

在选定的色谱条件下，离子的出峰顺序及出峰时间随着淋洗液的种类、流量和浓度的变化而改变，采用淋洗液发生器产生的 KOH 溶液为流动相，通过改变淋洗液的浓度和流量对色谱条件进行优化。当淋洗液初始浓度为 30 mmol／L，流量为 1.5 mL／min 时，氯离子和硫酸根离子分离度不能满足要求且基线出现大幅漂移现象；当淋洗液初始浓度为 10 mmol／L，流量为 1.0 mL／min 时，氯离子和硫酸根离子可以得到很好的分离且基线稳定，但碘离子的出峰时间滞后，峰型展宽较为严重，因此最终选择淋洗液初始浓度为 20 mmol／L，流量为 1.0 mL／min。在上述条件下 3 种阴离子混合标准溶液的离子色谱图见图 1。由图 1 可知，3 种离子的分离度较高，峰形较为理想。

2.2　样品前处理方法优化

蛋白胨样品中含有丰富的蛋白质、多肽、氨基酸、维生素、微量元素等物质，这些物质如果引入色谱分离体系，不仅易造成色谱柱污染、柱效下降，还会干扰对目标组分的分析。因此在提取氯离子、硫酸根离子、碘离子的同时，应该选择有效的方法将这些杂质去除。

分别用苦味酸、磺基水杨酸、三氯乙酸、乙醇、丙酮、乙酸锌和亚铁氰化钾对样品进行处理，结果表明均不能有效地去除基质干扰。最后选择在样品中加入 3% 的乙酸溶液配合 RP 柱去除有机化合物，采用 Na 柱去除其它离子的干扰，纯化样品，氯离子、硫酸根离子、碘离子可得到有效分离，如图 2 所示。

2.3　线性关系与检出限

在优化的仪器工作条件下，对 1.3 中氯离子、硫酸根离子、碘离子的系列标准工作溶液分别进样分析，以待测离子的质量浓度 (X ) 为横坐标，色谱峰面积 (Y ) 为纵坐标绘制工作曲线，各离子的线性方程、线性范围和线性相关系数见表 2。

氯离子、硫酸根离子、碘离子的进样浓度分别为 0.13，0.13，0.25 μg／mL，噪声分别为 118.4，30.1，3.4，以 3 倍信噪比 (S／N) 计算检出限，经计算得氯离子、硫酸根离子、碘离子的检出限分别为0.003，0.01，0.22 μg／mL。

2.4　精密度与准确度试验

按照 1.4 方法对样品进行前处理，在 1.2 仪器工作条件下测定蛋白胨中氯离子、硫酸根离子、碘离子3 种阴离子的含量。精密称取上述样品 9 份，进行 3个水平的加标回收试验，每个水平进行 3 次平行测定，结果见表 3。由表 3 可知，3 种阴离子的平均加标回收率分别为 96.59%，96.12%，92.94%，测定结果的相对标准偏差分别为 2.53%，5.70%，2.42%，说明所建方法的精密度和准确度良好。

3　结语

采用氢氧化钾淋洗液发生器在线生成淋洗液的方式，建立了分析蛋白胨中氯离子、硫酸根离子、碘离子的离子色谱分析法，对色谱条件和样品处理方法进行了优化。该方法能同时准确、快速测定蛋白胨中氯离子、硫酸根离子、碘离子的含量，方法的线性系数、检出限、精密度及回收率均满足分析检测的要求，方法具有推广实用价值。