体外消化对β-胡萝卜素大豆分离蛋白纳米颗粒黏液层渗透及跨膜转运

蛋白质纳米载体已被证实能够有效改善脂溶性营养素（例如β-胡萝卜素（BC））的生物利用率。然而，由于严苛的胃肠道环境、肠道黏液层屏障以及小肠上皮的跨膜限制，纳米载体的口服递送效果仍受到质疑。大豆分离蛋白（SPI）基纳米颗粒被认为是包载BC的理想载体，具有良好的生物相容性和可再生性。本课题组先前的研究发现，在经口吸收过程中，蛋白质载体容易受到极端胃肠条件的影响，界面蛋白发生水解，使得BC的疏水内核暴露于水相中；同时，肠液中的胆盐、磷脂等小分子活性剂会吸附到疏水内核表面，对BC进行再包埋，形成由蛋白水解肽、胆盐、磷脂、BC内核共同组成的尺寸在100 nm以下的重构载体。尽管这类重构载体在胃肠道中的稳定性较差，但在小鼠血浆中显示出良好的转运吸收效率。

近日，江南大学食品学院研究团队构建载有BC的SPI纳米颗粒，通过透射电子显微镜（TEM）、纳米粒度仪和高效液相色谱（HPLC）仪对纳米载体的形貌、粒度以及包封率等基本性质进行考察。进一步地，通过构建体外模拟消化模型，获取消化后的重构纳米载体，并对其基本结构特性进行分析。最后，采用人体结肠癌细胞系（Caco2）的分化模型与HT29细胞系共培养，模拟小肠上皮细胞的黏液层和紧密细胞膜结构，以评估消化后重构纳米载体在黏液层中的渗透性以及在小肠上皮细胞中的转运效率和转运模式。旨在探讨消化过程对蛋白质纳米载体结构的影响以及重构纳米载体突破黏液层和跨膜转运双重吸收屏障的能力及可能机制，以期为进一步明确纳米载体口服递送的有效性提供实验依据。

1 BC-SPIs结构性表征

SPIs的多分散系数（PDI）为0.39，粒径分布较为均一，其电位低于－20 mV，表明其颗粒稳定性较高。包封BC后，平均粒径较包封前有所增大，可能是因为BC被包埋进入到颗粒内部，使颗粒膨胀。BC-SPIs电位的绝对值较包封前有所提高，说明载入BC后纳米颗粒整体稳定性有了进一步提高。BC-SPIs中BC的包封率为40.21%。

使用TEM进一步观察BC-SPIs的形貌结构。BC-SPIs形态呈球形颗粒。比较发现，利用纳米粒度及Zeta电位分析仪测得的BC-SPIs平均粒径比TEM图像中观察到的更大，这是因为TEM观察的是干燥状态下的颗粒形貌，而米粒度及Zeta电位分析测量的是颗粒在溶液中的尺寸。在水溶液中，颗粒的表面存在水化层，在TEM干燥制样的过程中，水分蒸发会破坏水化层，使颗粒失水皱缩，导致尺寸变小。

2 BC-SPIs在消化过程中的结构特性变化

2.1 消化过程中BC-SPIs的粒径变化

在SIF消化的整个过程中，BC-SPIs粒径逐渐增大，这是因为SIF消化液中存在的胰蛋白酶使BC-SPIs界面蛋白上的赖氨酸残基、精氨酸残基等被切断，界面蛋白层被破坏，使疏水基团暴露，分子发生聚集，形成大的聚集体，导致粒径上升，并在随后的消化过程中结构继续展开，使颗粒不断聚集，粒径持续增大。同时，BC-SPIs在与SIF消化液混合0 min时的粒径明显增大，这是因为消化液的高离子浓度造成纳米颗粒表面电荷降低，从而发生了颗粒的部分聚集。

2.2 消化过程中BC-SPIs的界面蛋白组成、Zeta电位及其胆盐吸附情况

在SIF消化的过程中，BC-SPIs的界面蛋白在消化的前5 min内，蛋白条带密度明显下降，降解后的条带主要集中在分子质量低于37 kDa的区域内，印证了2.2.1节中颗粒粒径的增大。消化后的蛋白水解产物易与胆盐发生疏水相互作用，结合水相中的游离胆盐，而带不同负电的胆盐在颗粒表面的吸附会改变颗粒的表面电荷。经过SIF消化后，BC-SPIs的表面Zeta电位绝对值增加，电位变化越大，说明界面蛋白被胆盐取代的程度越高。通过透析法测定了消化后胆盐在BC-SPIs表面上的吸附情况，结果表明消化液中有56.37%的胆盐吸附于BC-SPIs消化2 h后的颗粒表面。

3 消化前后BC-SPIs的黏液层渗透及细胞跨膜转运的考察结果

3.1 利用Caco2单层细胞模转运模型考察的结果

3.1.1 细胞跨膜电阻和荧光素钠渗透性

细胞跨膜电阻反映的是细胞模型在分化时细胞间连接的紧密程度，可用于表征细胞膜的完整性，电阻高于250 Ω·cm2代表细胞膜紧密程度良好。Caco2细胞模型在培养分化21 d后跨膜电阻达到890.44 Ω·cm2，说明细胞膜紧密程度高，适用于吸收转运实验。

荧光素钠（分子质量为376 Da）渗透性可用以表征单层细胞膜的紧密连接程度。在前15 min内就已有大量荧光素钠穿透空白膜（对照），而Caco2细胞模型在孵育4 h后也仅有2.59%的荧光素钠通过细胞膜，说明细胞膜致密程度良好。

3.1.2 细胞膜的分化程度

除了单层膜的紧密程度和完整性，其顶端功能酶系的发育程度也是考察单层膜是否适合评价化合物转运吸收的另一项重要指标。在孵育分化过程中，Caco2单层细胞膜AP端酶系会逐渐成熟，直至酶活力不变。尽管平行样品间酶活力的基础值有所差异，但由于BL端的酶活力在孵育期间相对稳定，故可用AP端与BL端ALP活力的比值（AP/BL比值）来评价单层细胞膜的分化程度。如图5所示，在培养分化的过程中，AP/BL比值随着培养时间的延长逐渐增加，在19 d时达到比较稳定的状态，表明单层细胞膜顶端酶系的生长已经成熟，顶端酶系不再发生变化。

3.1.3 BC-SPIs细胞毒性考察

Narain等报道胆盐分子在胃肠道中作为阴离子表面活性剂，某些浓度下会表现出细胞毒性，说明消化液中胆盐的存在会提高消化产物的细胞毒性，而本实验消化后样品中含有游离的胆盐分子，因此有必要先进行安全实验再进行后续实验。以细胞存活率不低于75%作为标准，确定未被消化的BC-SPIs安全的最低稀释倍数为5 倍，消化后产物安全的最低稀释倍数为10 倍。消化液中BC质量浓度经HPLC定量为44 μg/mL，根据消化后产物的安全稀释倍数确定Caco2细胞模型中BC最高添加量为4.4 μg/mL。

3.2 利用Caco2-HT29共培养细胞模型的考察结果

3.2.1 细胞跨膜电阻和荧光素钠渗透性

Caco2/HT29共培养的细胞模型在21 d后细胞跨膜电阻为720.44 Ω·cm2，低于Caco2细胞跨膜电阻。这是因为Caco2细胞之间能非常紧密地连接，而HT29细胞会改变细胞的连接程度导致跨膜电阻降低。Caco2/HT29细胞跨膜电阻大于130 Ω·cm2，被认为细胞单层连接较为紧密，能够形成致密的单层细胞模型。

Caco2/HT29共培养细胞模型在孵育4 h后，仅有3.38%的荧光素钠通过细胞膜，远低于空白的聚碳酸酯膜（对照），这说明经过Caco2/HT29共培养细胞模型细胞膜致密，可用于后续研究。

3.2.2 细胞膜顶端ALP活力

在21 d的培养过程中，AP/BL比值在17 d时达到稳定，表明在共培养细胞模型的顶端酶系已经成熟，未受到黏液层的影响。

3.2.3 黏液层染色实验结果

为了确认HT29细胞在共培养细胞模型黏液层中的形成，使用阿利新蓝对不同生长阶段的单层细胞表面进行染色。Caco2细胞中只能检测到极为少量的黏蛋白。而对于HT29细胞，无论是单独培养还是和Caco2细胞共培养，都可以分泌大量的黏蛋白。在HT29细胞单独培养时，培养14 d时黏液的分布就已经很均匀，而共培养模型则在21 d时黏液量最多，形成了含有黏液层的小肠上皮细胞跨膜模型。

3.2.4 BC-SPIs细胞毒性考察

其结果与Caco2细胞毒性实验结果一致，以细胞存活率不低于75%作为标准，确定未被消化的BC-SPIs安全的最低稀释倍数为5，消化后产物安全的最低稀释倍数为10。最终确定后续实验时Caco2-HT29共培养模型中的BC添加量统一为4.4 μg/mL。

3.3 利用Caco2-HT29共培养细胞对BC-SPIs的吸收、转运效率考察结果

3.3.1 BC-SPIs的细胞吸收

细胞内BC的代谢产物主要是视黄醇和视黄醇棕榈酸酯，而维生素A酸和BC只占很少一部分。消化后BC-SPIs在Caco2-HT29共培养细胞内的BC及其代谢产物积累量显著高于消化前颗粒。2.2.2节中已证实BC-SPIs在消化后表面上吸附了大量的胆盐分子。有研究表明胆盐修饰可以通过降低肠道黏液层的黏度和弹性促进颗粒的黏液层渗透性；同时有研究表明，还可通过增强生物膜流动性和通透性、降低细胞间紧密连接程度、抑制其外排作用等特性促进携带营养素的纳米颗粒在小肠上皮细胞膜的吸收。

3.3.2 BC-SPIs的转运

消化前后的BC-SPIs在Caco2-HT29共培养模型中的转运情况，整体来看，经过细胞代谢进入体循环的BC及其代谢产物的分布规律与细胞中积累的规律基本一致，代谢产物仍主要为视黄醇和视黄醇棕榈酸酯。对比未被消化的BC-SPIs，消化后在细胞中以及BL端检测到的BC及其代谢产物更多。上述研究结果表明BC-SPIs在消化过程中发生的结构转化改善了转运吸收效率，一方面可能是因为胆盐在颗粒表面的吸附突破了黏液层屏障，增加了颗粒的黏液层渗透性；另一方面也可能是因颗粒结构改变引起转运模式的变化，从而提高了其转运效率。为了验证上述假设，通过后续实验进行了进一步考察。

3.4 消化前后BC-SPIs的黏液层渗透性及转运模式的考察结果

3.4.1 消化前后BC-SPIs的黏液层渗透性

为进一步探究消化改善BC-SPIs转运吸收特性的机制，分别对消化前后BC-SPIs的黏液层渗透性和跨膜转运模式进行考察。尽管BC-SPIs在消化后具有更大的粒径和更多的负电荷，但能够穿透细胞模型黏液层的整体VA当量较消化前有所增加。负电荷数量的增加和尺寸的增大会阻碍颗粒在黏液层中的迁移，而胆盐吸附则能增强颗粒在黏液层的渗透性，综合来看，表面胆盐的修饰作用要大于表面电荷和粒径变化带来的影响。结合所述BC及其代谢产物的胞内积累量和转运量，发现消化后的BC-SPIs跨越黏液层屏障的能力提高了0.48 倍。

3.4.2 消化前后BC-SPIs在Caco2细胞中的吸收、转运效率

消化后的BC-SPIs除了黏液层渗透性得到了提高，其跨膜吸收量也有所提升。与Caco2/HT29共培养模型对比来看，Caco2细胞中所积累的BC及其代谢产物含量更高，这可能是由于共培养模型中的黏液层会阻碍了BC-SPIs与Caco2细胞的接触，导致BC-SPIs穿透黏膜层进入到小肠上皮细胞中效率变慢，积累量降低。

与胞内吸收的结果类似，相比Caco2/HT29共培养模型，Caco2模型中所转运的BC及其代谢产物含量更多，代谢规律趋势与共培养模型类似。结合表5和表6中所述胞内积累和转运BC含量，发现消化后的BC-SPIs跨膜转运量提高了0.56 倍。

3.4.3 消化前后BC-SPIs的单层细胞膜转运模式

目前的观点认为大部分BC-SPIs是通过内吞作用进入到细胞内部。内吞作用途径包括网格蛋白依赖的内吞作用、小窝蛋白依赖的内吞作用、非网格蛋白和小窝蛋白依赖的内吞作用、巨胞饮作用、小窝/脂阀依赖的内吞作用，分别可以通过使用内吞作用抑制剂（氯丙嗪、吲哚美辛、槲皮素、β-环糊精和阿米洛利排除特定的内吞作用，阐释转运BC-SPIs的内吞作用机制。

当用不同的抑制剂处理细胞时，细胞对BC-SPIs的相对吸收率有不同程度的降低。与37 ℃正常温度的转运相比，细胞转运在4 ℃时受到明显的抑制。说明BC-SPIs的转运方式主要是需要能量的主动内吞作用。使用氯丙嗪和吲哚美辛处理细胞时，BC-SPIs的相对吸收率减少50%左右，说明网格蛋白依赖的内吞作用和小窝蛋白依赖的内吞作用对BC-SPIs的转运起重要作用。

而当BC-SPIs经过消化后转运时，不仅是吲哚美辛和氯丙嗪能够抑制其内吞作用，阿米洛利也显著影响了颗粒的转运，说明消化后颗粒的转运模式主要为网格蛋白依赖的内吞作用、小窝蛋白依赖的内吞作用和巨胞饮作用。

为了进一步明确消化后颗粒转运模式发生变化的原因，对可能的消化条件影响因素进行了验证。在4 种消化模式中，仅添加胆盐促进了小窝蛋白和网格蛋白依赖的内吞作用，并不会引发巨胞饮；而仅添加胰蛋白酶则会促进巨饱饮作用。产生这种差异的原因，可能在于在不同消化条件影响下，BC-SPIs结构产生了不同程度的变化。在消化前，由于BC-SPIs的粒径（＜200 nm）以及颗粒带负电的原因，导致细胞转运纳米颗粒的主要方式是网格蛋白以及小窝蛋白依赖的内吞作用。经过消化后，由于胰蛋白酶的作用，颗粒在消化过程中发生絮凝，导致颗粒的粒径增加，从而促进巨饱饮作用的产生，而胆盐与颗粒的相互结合导致颗粒带有更多的负电，影响了小窝蛋白依赖的内吞作用。而在消化前后溶液中都存在200 nm以下的颗粒，因此对网格蛋白依赖的内吞作用影响不大。

4 结 论

BC-SPIs经消化后界面蛋白水解、颗粒尺寸增加，且一定量的胆盐分子吸附于表面。消化后的颗粒在小肠上皮细胞膜的吸收转运量较初始颗粒有所增加，一方面是因为表面吸附的胆盐促进了消化后的颗粒在黏液层的渗透，提高了小肠上皮细胞膜的跨膜转运量；另一方面则是因为颗粒结构变化带来的转运途径的增加，在小窝蛋白和网格蛋白依赖的内吞作用基础上，增加了巨胞饮转运途径，减少了黏液层和跨膜转运双重吸收屏障的限制，促进了细胞对BC的吸收和利用。

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