不同植物DNA条形码对铁皮石斛的鉴定能力（二）

2 结果与分析

2.1 序列测定与比对

9 条DNA条形码序列在35 份石斛属植物共得315 条序列。将所得序列均通过NCBI进行BLAST相似性检验。将比对的结果进行分类总结，测序所得序列与NCBI数据库中已知的11 种石斛属序列的同源性为100%，对比结果也说明本实验的测序结果可靠准确。

2.2 不同条形码特征分析

不同植物DNA条形码序列的具体特征信息见表3。结果显示，不同DNA条形码的序列全长介于456～809 bp之间，trnG-trnS片段序列最长，平均为775 bp，ITS2基因序列最短，平均为457 bp。9 种DNA条形码序列GC含量介于24.1%～57.9%，其中ITS2基因GC含量最高，平均为53.8%，trnG-trnS片段序列GC含量最低，平均为24.5%。考察各DNA条形码的引物在不同材料中的扩增率，其中matK序列扩增率为91.4%，大包鞘石斛和束花石斛没有得到扩增，可能是这2 个材料中的matK序列有变异或进化。其余8 条DNA条形码扩增率均为100%；9 条DNA条形码的测序成功率均为100%。变异率反映序列的变异程度，其中ITS2、trnL-trnF和trnG-trnS的变异率较高，均超过20%，说明这些序列进化速率较快。

表3不同DNA条形码基本特征信息

2.3 DNA条形码遗传距离分析

DNA条形码应具有足够小的种内变异与明显的种间变异，在遗传距离上即要求种内差异最大值小于种间差异最小值。对11 种石斛属的9 条DNA条形码序列进行种内与种间遗传距离计算（表4）。结果显示，在铁皮石斛种内，nad1、matK、psbK-psbI、trnG-trnS的序列没有变异，其在铁皮石斛种内遗传距离为0。种内遗传距离大小顺序为rbcL＞ITS2＞trnH-psbA＞trnL-trnF＞ycf1b。石斛属种间遗传距离统计结果显示，ITS2的种间遗传距离最大，平均为0.074 4，nad1的种间遗传距离最小，平均为0.004 5。种间遗传距离大小顺序为ITS2＞trnG-trnS＞trnL-trnF＞psbK-psbI＞ycf1b＞rbcL＞matK＞trnH-psbA＞nad1。其中，rbcL与trnH-psbA种内最大遗传距离大于种间最小遗传距离，不符合DNA条形码对遗传距离的要求，其余条形码种内最大遗传距离小于种间最小遗传距离。

表4 种内、种间遗传距离

进一步利用种内与种间K2P遗传距离得到“barcoding gap”分布图，ITS2、nad1、matK、ycf1b、psbK-psbI、trnL-trnF、trnG-trnS基因及片段序列存在“barcoding gap”，有小部分重叠。ycf1b、matK、nad1与psbK-psbI序列遗传距离分布频率在图中整体分布呈正态分布向种内方向倾斜；ITS2、trnL-trnF及trnG-trnS序列种内变异差异和样本分布的比例明显较小，而品种间的样本分布和变异差异明显较大，有利于铁皮石斛资源的鉴定。而rbcL与trnH-psbA序列不存在“barcoding gap”且品种间和品种内变异重合，不适合用于铁皮石斛资源的鉴定。

2.4 不同序列变异的Wilcoxon秩和检验

根据遗传变异分化的不同，采用SPSS 20.0统计软件对7 条候选DNA条形码序列遗传距离进行种间Wilcoxon秩和检验，分析两两序列种间的变异情况作为筛选候补DNA条形码的一个指标。根据P＜0.05为显著性差异的原则，ITS2序列的检验值最大，其余序列种间距离变异差异大小顺序为ITS2＞trnL-trnF＞trnG-trnS＞psbK-psbI＞ycf1b＞matK＞nad1，与种间变异分析结果一致。

2.5 DNA条形码鉴定分析

DNA条形码分辨率是判断选择的条形码是否合适的标准之一。通过NJ进化树个体聚成一支且支持率不小于50%可认为鉴定成功。ITS2、ycf1b、psbK-psbI以及trnL-trnF序列可将铁皮石斛资源以近似50%的支持率，单独聚为一支；其余3 种未能得到较好的区别，nad1序列将重唇石斛、鼓槌石斛、钩状石斛等7 种与铁皮石斛聚为一支，matK序列将铜皮石斛、肿节石斛、重唇石斛等5 种与铁皮石斛聚为一支；trnG-trnS序列将金钗石斛、喇叭唇石斛、重唇石斛等6 种与铁皮石斛聚为一支。。其中，nad1序列分辨率最低，为36.3%，ITS2与trnL-trnF序列分辨率最高，为90.1%。根据实验结果，推荐使用ITS2和trnL-trnF序列作为铁皮石斛资源鉴定的DNA条形码。

进一步，将ITS2和trnL-trnF2个片段组合，进行NJ进化树的构建。通过NJ树个体聚成一支且支持率≥50%可认为鉴定成功。11 种石斛都能成功鉴定。推荐使用ITS2+trnL-trnF组合序列作为铁皮石斛资源鉴定的DNA条形码。

3 讨 论

DNA条形码技术由于其受环境条件或材料品质等影响较小，所需样品量少、鉴定准确性高、方便快速等优点，被广泛应用到铁皮石斛的鉴定。目前，应用到植物鉴定和分类的DNA条形码有很多，主要为叶绿体的基因片段，叶绿体基因的间隔区，还有来源核基因片段。本研究选择了目前比较常用的植物DNA条形码，其中叶绿体基因片段为rbcL、ycf1b、matK，叶绿体基因的间隔区trnH-psbA、psbK-psbI、trnL-trnF、trnG-trnS，ITS2为核基因片段，nad1则为线粒体基因。主要从通用性和分辨率等方面探讨它们对铁皮石斛鉴定的适合程度。

在通用性方面，主要比较了9 种DNA条形码的扩增性和测序成功率。整体而言，通用性都比较强，其中matK扩增率91.4%，相较与其他条形码，其通用性稍差。之前就有报道，matK基因虽然是叶绿体基因组编码蛋白中进化最快的基因，但其引物通用性一直饱受争议。DNA条形码的扩增性直接影响其应用范围和效果。如果一个DNA条形码其扩增性不强，通用性比较低，即使它的分辨率很高，也很难得到推广和应用。为了提高条形码的通用性，一般选择扩增效率高的引物，及更短的片段，即微型DNA条形码，这种微型DNA条形码更适合DNA受到降解或DNA难以提取样品的鉴定。

本研究对DNA条形码序列测序、校正，计算遗传分化距离，并利用Wilcoxon秩和检验和建立NJ树等分析方法，评价它们对铁皮石斛及其他石斛的分辨能力。虽然rbcL和trnH-psbA在植物类鉴别与分类中经常使用，但在本实验中，它们在铁皮石斛种内的最大遗传距离却大于其他石斛种间的最小遗传距离，不适合用于铁皮石斛与其近缘石斛之间的鉴定。另外7 条DNA条形码满足种内最大遗传距离小于种间最小遗传距离的要求，初步判定可作为鉴定铁皮石斛的候选条形码。其中，nad1基因序列所含的变异位点少，进化速度慢，对本实验中石斛材料的分辨率为36.3%。丁鸽等利用nad1序列研究金钗石斛和其混合品亲缘关系时，也发现该序列变异程度不高。进一步体现了植物线粒体基因进化速度慢的事实，在选择此类基因作为DNA条形码时更需要筛选和验证。

ttrnL-trnF基因片段位于叶绿体基因非编码区的大单拷贝区，约为600～1 400 bp，因为进化速率较快，适合作为DNA条形码。一方面这两个条形码的分辨率高，另一方面，ITS2为核基因组条形码，trnL-trnF为叶绿体条形码，这两个不同来源的基因片段可能在不同的类群中存在不同的分辨率，两者的结合，则有效提高分辨率。ITS2+trnL-trnF的组合能对本实验中所选的11 种石斛属材料进行鉴定，然而我国石斛种类有70 多种，ITS2+trnL-trnF的组合是否适合更多石斛材料的鉴别，还需要进一步研究。

4 结 论

本研究比较分析了9 种常用植物DNA条形码对11 种石斛属材料的鉴别能力，9 种条形码的扩增性及通用性良好，不同条形码对所测试石斛属材料的鉴别能力有差异，其中ITS2序列和trnL-trnF片段序列的鉴定能力最高，分辨率均达到90.1%。将ITS2序列和trnL-trnF序列相结合，对所用石斛属材料达到了100%鉴定，推荐推荐使用ITS2+trnL-trnF组合作为铁皮石斛资源鉴定的DNA条形码。

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