靶向Ｇ蛋白偶联受体的肽类药物（一）

摘要  G蛋白偶联受体( G protein-coupled receptors，GPCRs )是哺乳动物体内最大的细胞膜表面受体家族,具有7次跨膜螺旋结构。人类基因组编码约800种不同类型的GPCRs,广泛参与了代谢性疾病及肿瘤等多种重大疾病的病理过程,使之成为药物研发的热门靶点。肽是介于氨基酸和蛋白质之间的一类物质,由两个至几十个氨基酸通过肽键连接而成,是涉及生物体内多种细胞功能的生物活性物质。迄今为止,研究者已鉴定出7 000余种天然肽,分别作为激素、神经递质、生长因子、离子通道配体和抗生素等发挥功能。肽类药物因具有作用机制明确、安全性好、生产成本低等多重独特优势及其在空间结构上近乎无限的可能性而逐渐受到重视。

近年来,基于对CPCR结构的理解不断深入,靶向GPCR的肽类药物发展迅猛,新药不断上市。目前为止,美国食品和药物管理局(FDA)已批准上市近50种靶向CPCR的肽类药物,用于治疗代谢性疾病、神经系统疾病和癌症等多种疾病。肽类药物的研发经历了人体肽开发、天然肽开发和生物技术开发3个阶段。目前,已上市的靶向GPCR肽类药物大多是对人体天然内源性多肽类配体的改造与修饰。本文归纳了近年来研发成功已上市的靶向GPCR肽类药物,并简要总结了目前肽类药物的研发策略及未来潜在的发展方向,旨在为更多靶向GPCR肽类药物的研发提供参考。

作为人体内最大的细胞膜表面受体家族,G蛋白偶联受体(G protein coupled receptors，GPCRs)参与了包括糖尿病、心血管疾病、自身免疫病、肿瘤等在内的多种重大疾病的病理过程。靶向CPCR药物的开发一直是药物研发的热点,美国食品和药物管理局(FDA)批准的全部药物中有超过1/3都以GPCR为作用靶点。肽是介于氨基酸和蛋白质之间的一类物质,由2个至几十个氨基酸通过肽键连接而成。迄今为止,已鉴定出7000余种天然肽,分别作为激素,神经递质、生长因子,离子通道配体和抗生素等发挥功能。在人体内,肽类参与多种重要生理过程:例如胰岛素( insulin)促进糖原、脂肪和蛋白质的合成代谢,发挥降血糖的作用;又如催产素( oxytocin)在分娩过程中促进子宫平滑肌的收缩,并刺激乳腺射乳反应。肽作为一类信号分子,通过结合细胞膜表面受体,例如GPCRs ,离子通道( ion channels)等,启动特定的细胞信号转导过程。近年来,肽类药物逐渐引起医药界的重视,其凭借生物活性高、安全性好、生产成本低等特性及其在空间结构上近乎无限的可能性被视为药物研发的新增长点。在本篇综述中,归纳了研发成功已上市的靶向GPCR肽类药物,并简要总结了目前肽类药物的研发策略和未来可能的发展方向。

1 G蛋白偶联受体及其信号转导通路

人类基因组编码超过800种 GPCR,其配体可以是小分子糖类、脂质和多肽,也可以是蛋白质等生物大分子。GPCR的共同特点是其立体结构包含7个跨膜α螺旋,因此又被称为7次跨膜受体,同时其胞内区有G蛋白(鸟苷酸结合蛋白)结合位点7。根据其结构的相似性,GPCR可被分为5类,分别是:视紫红质样家族( rhodopsin-like family)、分泌素受体( secretin receptors )、代谢型谷氨酸受体( metabotropic glutamate receptors)、黏附素受体( ad-hesion receplors)以及Frizzled/Taste2受体( Frizzled/'Taste2 receptors )。2012年,诺贝尔化学奖授予了美国科学家Robert J. Lefkowitz和 Brian K. Kobilka ，以表彰他们在CPCR功能及结构研究中的突出贡献。他们的工作推动了CPCR结构生物学的大发展,新的GPCR 结构不断被解析公布,使人们对GPCR的结构复杂性及其信号传导的复杂性有了更深入的认识。

经典的GPCR信号转导由C蛋白介导。G蛋白是由Ga 、Gp.Gy三个亚基组成的异源三聚体。其中 ,Gα 亚基是具有GIP酶活性的分子开关蛋白质,Gβ和Gy则以二聚体形式紧密结合。Gα有4种亚型:Go..Gx;,. .Gαg和 Gorws。每种亚型结合不同的效应器蛋白质,效应器蛋白质可以直接或通过第二信使进一步激活下游效应(见Table 1 )。

以Gα.为例:CPCR与配体结合后构象发生改变,活化的受体与G蛋白三聚体α亚基结合,导致Go亚基上的GDP与胞质中的GTP交换, Go亚基与受体和Gβy亚基解离,结合并激活腺苷酸环化酶( adenylate cyclase，AC) ,进而使细胞内环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)浓度增高，cAMP与蛋白质激酶A( protein kinase A，PKA)调节亚基结合,导致催化亚基被释放并入核,使cAMP应答元件结合蛋白质(CREB)磷酸化,磷酸化的CREB与核内CREB结合蛋白质(CBP)特异结合形成复合物,复合物与靶基因调控序列结合,激活靶基因转录。分离的Gβy亚基也可以激活下游效应分子,例如磷脂酶C( phospholipase C，PLC), PLC可将磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸( phosphatidylinositol-4,5-bi-sphosphate，PIP,)水解成第二信使肌醇三磷酸( inositol-1 ,4 ,5-trisphosphate，IP,)和二酰甘油( di-acylglycerol，DAG)——IP。刺激细胞内质网释放Ca进入细胞质基质,使胞内Ca*浓度升高;DAG激活蛋白质激酶C( protein kinase C，PKC) ,进而触发MAPK(mitogen activated protein kinase)信号通路(见Fig.1)。

GPCR另一种信号转导机制由GPCR激酶( CRKs)和抑制蛋白( arrestin)介导。GPCR与GRKs结合导致受体磷酸化,从而终止 GPCR 与G蛋白的相互作用;同时, CPCR磷酸化还启动GPCRs与β-抑制蛋白结合。传统观点认为,β-抑制蛋白是作为GPCR信号通路的负反馈调节机制存在的。近年来发现,其也能启动非G蛋白依赖的下游信号通路。某些配体与GPCR结合可导致受体选择性与不同亚型的G蛋白或β-抑制蛋白相互作用,从而有偏向性地激活某些特定的信号通路,这些配体被称为“偏向性配体”。具有偏向性的配体与受体结合可激活β-抑制蛋白通路,β-抑制蛋白可以与许多下游效应蛋白质相互作用,例如MAPK 、PKB( protein kinase B)等,在 GPCR 信号转导过程中发挥关键作用。这一发现为靶向GPCR药物的研发提供了新的方向;具有偏向性的配体能特异性地激活G蛋白或者β-抑制蛋白介导的信号通路,相比传统配体其表现出更强的靶向性,这对提高药效有重要的意义。

2 肽类药物及其研发策略

多肽作为药物具有许多独特的优势:( 1)大量天然肽类可作为配体作用于细胞膜表面受体。据此开发的肽类药物作用机制明确、生物活性高、用药剂量小;(2)与小分子药物相比,肽类药物不通过肝的代谢,其代谢产物为氨基酸,几乎无毒性且一般不会在特定器官组织中累积,因此副作用发生率低,安全性好;(3)与蛋白质等生物大分子相比,肽类药物易于合成,容易与杂质或副产品分离,纯度高,且其研发周期短,生产成本低,易满足中等规模治疗的需要。鉴于这些良好的药理特性和固有优势,肽类药物成为近年来新药物研发的热点。目前,已有50多种靶向GPCR肽类药物被美国FDA批准,其中大多数用于代谢性疾病或肿瘤的治疗,肽类药物的研发经历了人体肽开发、天然肽开发和生物技术开发3个阶段。最初的关注点集中于对人体肽类激素的开发和利用。目前,上市的药物大多都是用这个策略合成的,最为典型的例子是胰岛素。上世纪80 ~90年代,研究者利用重组DNA技术制造出高纯度的生物合成人胰岛素,并通过对肽链进行修饰合成了胰岛素类似物,实现了速效和长效。上世纪末,研究人员将探索范围扩大到存在于微生物、植物、动物毒液中的天然肽类。例如，用于2型糖尿病及肥胖症治疗的Exendin-4。继对天然肽类的大规模挖掘之后,肽类药物的研发走上了利用分子生物学技术进行筛选和开发的必由之路。

利用分子生物学技术开发肽类药物的两大基础是高丰度肽库的建立和合适的筛选策略。1985年，George P Smith通过将肽段融人噬菌体表面蛋白质，开发出了噬菌体展示技术( phage display)。1990年,George P Smith 与 Jamie K Scott将随机序列肽展示在噬菌体表面,建立了噬菌体展示随机肽库。噬菌体展示技术通过多轮亲和筛选,可在高丰度随机肽库(丰度可达10°)中筛选出与靶蛋白质具有高亲和力的肽段,通过 DNA测序确定候选肽的编码信息,从而将肽段与靶蛋白质的亲和力属性( pheno-type ，affinity )与肽段遗传信息( genotype，DNA se-quence)相关联。随后,新的mRNA展示技术、核糖体展示技术和酵母展示技术等不断涌现,它们与噬菌体展示技术一起在过去20年中不断得到发展与优化,理论上能够针对任何靶蛋白质进行基于亲和力的高通量筛选。

2014年,美国Scripps研究所Lerner课题组利用一种哺乳动物细胞系中的自分泌信号系统( auto-crine-based signaling system) ,成功筛选出GLP-1R的新型肽类激动剂P5作为治疗型糖尿病的潜在药物。这项技术通过血小板源生长因子受体跨膜结构域(PDCFR-TM) ,将候选肽段展示于哺乳动物细胞表面,结合目标跨膜蛋白质的功能报告系统，利用流式细胞术与高通量测序筛选靶向跨膜蛋白质的肽类激动剂。该系统通过在哺乳动物细胞中过表达目标跨膜蛋白质,而非固相化的重组蛋白质,最大程度上保持了其天然状态,并且利用报告系统实现了基于功能的筛选。

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