烹饪时间对西兰花中萝卜硫苷的影响（一）

西兰花（Brassica oleracea var. italica）是十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种，含有多种有益化合物，例如硫代葡萄糖苷（简称为硫苷）、蛋白质和VC等。硫苷是十字花科蔬菜中一种重要的次生代谢物质。西兰花中主要的硫苷有萝卜硫苷（glucoraphanin，GRA）、屈曲花苷、3-吲哚基甲基硫苷和1-甲氧基吲哚基-3-甲基硫苷，其中GRA占西兰花中总硫苷含量的50%以上。GRA本身并无生物活性，当植物受到机械损伤或被食用时，GRA与内源芥子酶（myrosinase，MYR）发生酶解反应生成一系列产物，包含异硫氰酸盐（isothiocyanates，ITC）、硫氰酸盐和腈。GRA的酶解产物萝卜硫素（sulforaphane，SFN）被认为是最有效的天然抗癌化合物之一，研究表明SFN能够抑制体内I相致癌酶的产生，诱导产生II相解毒酶，如谷胱甘肽硫转移酶、苯醌氧化还原酶和血红素氧化酶I等，并增强其活性和竞争性，抑制CYP2EI化学致癌基因的表达，从而保护DNA、RNA、蛋白质等体内大分子不受损伤。

日常生活中，大多数蔬菜在食用前一般都会经过烹饪加工，研究发现烹饪不仅会引起蔬菜中化学成分的显著变化，而且会影响化学预防化合物的生物利用度和含量。一些研究表明选择适当的烹饪方法可以增强化合物的可用性，从而改善健康状况。Rungapamestry等研究发现食用微波加热2 min的西兰花后，人体对SFN的吸收提高了大约3 倍。Tabart等用不同烹饪方式处理西兰花，微波烹饪的第1分钟SFN含量增加了4～6 倍，第5分钟SFN含量增加了1.7 倍。目前，大多数家庭主要采取蒸、煮、炒和微波的烹饪方式加工蔬菜。许多研究表明，煮、炒和微波这3 种烹饪方式会造成西兰花中硫苷和ITC的大量损失；相比之下，蒸制对其造成的损失最小，因此很多学者认为蒸制是较好的选择。

然而这4 种烹饪方式都会对西兰花中的内源MYR活性造成不可逆的损失和抑制，导致GRA-SFN转化和人体对SFN的吸收降低。为了增加人体对SFN的吸收，可以考虑在食用过程中添加外源MYR来提高GRA-SFN的转化率。本实验主要研究了4 种常用的家庭烹饪方式（蒸、煮、炒和微波）及烹饪时间对西兰花中GRA和SFN含量的影响，以及添加外源MYR对西兰花中GRA-SFN转化率的影响，以期为人们选择适宜的烹饪方法、提高西兰花有益化合物的获取量提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

以兰州桃海市场购买的新鲜‘瑞农’西兰花为实验材料，用蒸馏水冲洗干净，晾干后置于4 ℃冰箱待用。

甲醇（色谱纯）、乙酸乙酯、体积分数95%乙醇溶液、四甲基溴化铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、丙三醇、硫酸铵、抗坏血酸、二硫苏糖醇、聚乙二醇6000 甘肃中瑞化工有限公司；黑芥子硫苷酸钾、GRA、SFN标准品 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

多功能电热锅 山东淄博周村楠北电器厂；RE-52型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；DS-8510DTH型超声波振荡仪 上海生析超声仪器有限公司；雷磁DDSJ-308F电导率仪 上海仪电科学仪器股份有限公司； DW-86L390低温保存箱 青岛澳柯玛股份有限公司； BCD-642WDVMU1冰箱 青岛海尔股份有限公司； CTO-15C高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 烹饪方法

本实验采用了蒸、煮、炒和微波4 种烹饪方法，实验样品处理方法如下，所有处理均重复3 次。

蒸：准确称取西兰花5 g，称取6 份，按料液比1∶100在蒸锅内加入3 000 mL蒸馏水，800 W下加热至沸腾后，将称好的西兰花放置在蒸盘上分别蒸制0、1、2、4、6、8 min，处理完成后室温下冷却，吸液纸吸干表面的水后液氮速冻，置于低温冰箱（－70 ℃）待用。

煮：准确称取西兰花5 g，称取6 份，按料液比1∶100在蒸锅内加入3 000 mL蒸馏水，800 W下加热至沸腾后，将称好的西兰花放置在蒸锅内分别煮制0、1、2、4、6、8 min，处理完成后室温下冷却，吸液纸吸干表面的水后液氮速冻，置于低温冰箱（－70 ℃）待用。

炒：准确称取西兰花5 g，称取6 份，在蒸锅内加入10 mL菜籽油，油热后将西兰花倒入锅内进行翻炒。分别炒制0、1、2、4、6、8 min后室温下冷却，吸油纸吸干材料表面的油后液氮速冻，置于低温冰箱（－70 ℃）待用。

微波：准确称取西兰花5 g，称取6 份，将称好的西兰花放置在微波炉内，在700 W（中火）下分别加热0、1、2、4、6、8 min，处理完成后室温下冷却，液氮速冻，置于低温冰箱（－70 ℃）待用。

1.3.2 GRA提取及检测

1.3.2.1 GRA标准曲线的绘制

20 mg纯度为99%的GRA标准品溶解于20 mL去离子水中，质量浓度为1 mg/mL，配制5、20、40、80、120、160、200 μg/mL梯度溶液，建立GRA标准曲线及回归方程Y＝5 975.6X－6 995.9（R2＝0.999），式中，X为GRA质量浓度，Y为峰面积。

1.3.2.2 GRA的提取

参考叶珊珊的方法并略作改进。取1.3.1节制备的样品5 g，以料液比1∶4加入20 mL 80%（体积分数，下同）乙醇溶液，80 ℃下水浴20 min。过滤并收集滤液，将样品研磨成糊状，按料液比1∶12加入60 mL 80%乙醇溶液，80 ℃下水浴20 min，超声处理15 min，过滤并收集滤液，重复两次。合并滤液，55 ℃旋转蒸发浓缩至膏状。用甲醇溶解并定容至10 mL。

1.3.2.3 HPLC法测定GRA含量

利用HPLC仪检测GRA含量，采用Hypersil BDS C18柱（250 mmh 4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（体积比4∶96，含质量分数0.1%四甲基溴化铵）；流速 0.8 mL/min；柱温35 ℃；检测波长226 nm；进样量20 μL。测得峰面积代入1.3.2.1节回归方程计算GRA含量。

1.3.3 SFN的提取及检测

1.3.3.1 SFN的提取

参考胡翠珍等[22]的方法。黄芥子粉碎，过筛。称取5 g芥子粉按料液比1∶20加入蒸馏水100 mL，25 ℃超声振荡30 min后，抽滤除杂得粗MYR液，其中MYR活性为0.7 U/g（干质量）。取1.3.1节制备的样品5 g，以料液比1∶5加入25 mL MYR液（以相同体积蒸馏水作为对照），37 ℃水浴60 min后以料液比1∶20加入100 mL 95%乙醇溶液，超声处理30 min，过滤。收集滤液，65 ℃旋转蒸发至液体完全蒸干，10 mL蒸馏水冲洗蒸馏瓶，以体积比1∶3加入30 mL乙酸乙酯，萃取两次，合并乙酸乙酯相，50 ℃旋转蒸发溶液至膏状，用甲醇溶解并定容至10 mL。

1.3.3.2 SFN标准曲线的制作

20 mg纯度为99%的SFN标准品溶解于20 mL去离子水中，质量浓度为1 mg/mL，配制5、20、60、120、180、250 μg/mL梯度溶液，建立SFN标准曲线及回归方程Y＝3h 10－5X－0.510 4（R2＝0.999），式中，X为峰面积，Y为SFN质量浓度。

1.3.3.3 HPLC法测定SFN含量

利用HPLC仪检测SFN含量，采用WondaSil C18柱（150 mmh 4.6 mm，5 μm），有机相为甲醇，水相为超纯水，二元高压洗脱程序为：0.01 min 35%甲醇，12 min 35%甲醇，20 min 100%甲醇，25 min 35%甲醇；流速0.8 mL/min；柱温35 ℃；检测波长201 nm；进样量20 μL。将测得峰面积代入1.3.3.2节回归方程计算SFN含量。

1.3.4 西兰花中MYR的提取与测定

1.3.4.1 材料处理方法

准确称取西兰花2 g，称取6 份，按1.3.1节步骤分别制备蒸、煮、炒和微波制样品。所有处理均重复3 次。

1.3.4.2 MYR的提取及活性的测定

参考丁艳等的方法提取MYR并测定活性，略作改进。取1.3.4.1节制备的样品2 g，加入20 mL 10 mmol/L 磷酸钾缓冲液（其中添加1 mmol/L EDTA、3 mmol/L二硫苏糖醇、质量分数5%甘油，pH 7.2），冰浴研磨，4 层纱布过滤除滤渣，滤液在4 ℃下12 000 r/min离心15 min，取上清液，加入固体硫酸铵使上清液饱和度达到55%，4 ℃放置30 min，12 000 r/min冷冻离心15 min，使MYR聚集，取沉淀溶于4 mL去离子水中，并用去离子水透析4 ℃过夜，透析袋取出后表面擦干，放入盛有质量分数10%聚乙二醇溶液的烧杯内，4 ℃放置0.5 h，得到MYR提取浓缩液。在试管中加入1.50 mL磷酸钾缓冲液（pH 6.5）、500 μL抗坏血酸溶液（1 mmol/L）、50 μL黑芥子硫苷酸钾溶液（25.18 mmol/L）和20 μL MYR提取液，分别在37 ℃条件下保温，混合平衡1 min。置于1 cm光路石英比色皿中，37 ℃反应30 min，测定227 nm波长处吸光度，按公式（1）计算酶活力。在pH 6.5、37 ℃条件下，以每分钟催化1 μmol黑芥子硫苷酸钾所需要的酶量为一个酶活力单位（U）。

式中：n为反应时间内MYR降解黑芥子硫苷酸钾的物质的量/μmol；t为反应时间/min；VE为酶液体 积/mL；VEX为提取液体积/mL；m为样品质量/g。

1.3.5 细胞膜透性测定

细胞膜透性测定参考林毅雄等的方法。取1.3.4节中冷冻前蒸、炒和微波处理的样品2 g，置于25 mL试管内，加入20 mL去离子水，让样品完全浸在水中，将试管放置在干燥器用内真空泵抽真空30 min，电导率仪测定电导率R1，然后将试管沸水浴加热15 min，取出冷却至室温后测定电导率R2，相对电导率用公式（2）计算。

煮制样品电导率的测定：取1.3.4节冷冻前的煮制样品2 g，放置在加入20 mL去离子水的试管内，封口膜封口后放入蒸锅内分别加热0、1、2、4、6、8 min，取出试管室温下冷却，测定相对电导率。

以上处理均重复3 次。

1.4 数据统计与分析

用Excel 2010软件对实验数据进行整理并绘图，用SPSS 19.0软件对数据进行方差分析，并进行Duncan’s差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著。

相关链接：四甲基溴化铵，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，乙二胺四乙酸，西兰花，硫代葡萄糖苷，硫酸铵，抗坏血酸，北纳生物

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